3D打印三培养微纤维支架双阶段释放二甲双胍促骨血管神经再生

来源：EFL生物3D打印与生物制造

临界尺寸骨缺损的再生是临床难题，仅促进成骨不足，血管和神经支配对建立骨再生微环境至关重要，但现有支架多无法实现三者协同再生，且缺乏持续可控的释放模式。传统3D生物打印技术在构建三维组织修复支架方面存在局限性，且多数生长因子在促进骨再生的同时，难以兼顾神经和血管的生长调控。   

来自首都医科大学附属北京口腔医院的白玉兴教授、张珂教授合作开发了3D生物打印水凝胶微纤维（aMF）包埋人牙周膜干细胞（hPDLSCs）的三培养体系（含hPDLSCs、人脐静脉内皮细胞hUVECs和周细胞PCs），并将其整合到磷酸钙水泥（CPC）支架中，构建了二甲双胍双阶段释放系统。该系统通过第一阶段CPC释放二甲双胍招募内源性细胞建立初步微环境，第二阶段aMF降解后释放细胞与药物，促进三培养细胞互作及血管神经生成。实验证明，该支架显著提升骨、血管、神经再生量（分别为对照组2.5倍、3倍、3.5倍），其机制与TRIM26基因调控的信号通路相关。   

相关工作以“3D-printed microfibers encapsulating stem cells in scaffold with tri-culture and two-stage metformin release for bone/vasculature/nerve regeneration in rats”为题发表在《Bioactive Materials》上。

图1.研究设计示意图。(A) 3D 生物打印 aMF-CPC 支架已证明能够修复临界尺寸骨缺损。(B) 3D 生物打印 aMF-CPC 支架可促进骨骼、血管化和神经组织修复。(C) 基于 3D 生物打印人牙周膜干细胞（hPDLSCs）的三培养系统，该系统以 hPDLSCs 为基础，包含人脐静脉内皮细胞（hUVECs）和周细胞（PCs）。(D) 包含三培养细胞的长入血管横截面图示。(E) 三培养系统内发生的复杂相互作用动态。

1. 3D生物打印微纤维-磷酸钙水泥支架的设计与表征，通过FRESH技术与紫外固化工艺，制备了包埋人牙周膜干细胞（hPDLSCs）、人脐静脉内皮细胞（hUVECs）和周细胞（PCs）的三培养体系支架，并整合二甲双胍双阶段释放系统。利用扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶红外光谱（FTIR）和原子力显微镜（AFM）分析支架结构，结果显示其降解后形成100–300 μm大孔，力学性能（弯曲强度、弹性模量）优于松质骨，且二甲双胍在CPC（阶段一）和微纤维（aMF，阶段二）中实现持续释放，12天内累计释放率达85%。      

图2.3D生物打印aMF-CPC支架的结构设计、降解特性及药物释放曲线。   

2. 三培养体系的体外细胞行为与成骨分化，通过免疫荧光染色（PECAM1、Desmin）和活/死细胞染色，观察三培养细胞在微纤维中的分布与增殖。CCK-8实验显示，细胞比例为hPDLSCs:hUVECs:PCs=4:12:1时增殖活性最佳，碱性磷酸酶（ALP）活性和茜素红染色（ARS）矿化结节量在200 mg/mL二甲双胍作用下显著提升，成骨基因（ALP、Runx2）表达上调2–3倍，证实三细胞互作协同促进成骨与血管生成。      

图3.三培养体系的细胞形态、存活率及成骨分化能力验证。

3. 细胞比例优化与体外成骨活性对比，通过设置不同hPDLSCs:hUVECs:PCs比例（如4:12:1、1:3:1），结合ALP染色和ARS矿化结节分析，筛选出最佳三培养比例为4:12:1，该比例下细胞成骨分化活性最高，矿化结节面积较单一培养组增加3.5倍，表明细胞间相互作用对再生效果至关重要。      

图4. 不同细胞比例的三培养体系成骨分化活性对比及最佳比例筛选。

4. 体内骨缺损修复与血管神经再生评估，在大鼠颅骨5 mm缺损模型中植入支架，通过Micro-CT、HE染色、Masson染色及免疫组化（CD31、CGRP）分析。结果表明，术后12周时，三培养+双阶段二甲双胍组的新生骨体积/组织体积（BV/TV）为阴性对照组的2.5倍，血管密度（CD31+）和神经纤维密度（CGRP+）分别提升3倍和3.5倍，炎症因子IL-1β、TNF-α表达降低60%以上，显示支架显著促进骨、血管、神经协同再生。      

图 5. 不同 3D 生物打印 aMF-CPC 支架的体内成骨分析。

图 6. 体内 3D 生物打印 aMF-CPC 支架血管化的组织学分析。

图 7. 体内 3D 生物打印 aMF-CPC 支架神经支配的组织学分析。  

5. TRIM26基因调控机制与信号通路解析，运用RNA测序和蛋白质免疫印迹（Western blot），发现二甲双胍显著上调TRIM26基因表达（log2FC=1.8），激活cAMP-MAPK通路并促进Runx2蛋白表达。抑制或敲低TRIM26后，成骨和血管生成相关指标显著下降，证实TRIM26是调控三组织再生的关键因子，其机制与神经营养因子通路协同作用相关。      

图8.三培养体系在二甲双胍作用下的差异基因表达谱、TRIM26互作网络及信号通路验证。   

研究结论
本研究开发了基于人牙周膜干细胞的三培养体系，并构建了3D生物打印微纤维-磷酸钙水泥（aMF-CPC）支架，实现了二甲双胍的双阶段释放及骨、血管、神经组织的协同再生。实验表明，该支架通过三培养细胞间的复杂相互作用（hPDLSCs、hUVECs、PCs），显著提升了成骨、血管生成和神经支配能力：与阴性对照组相比，术后12周新生骨量增加2.5倍，血管和神经 ingrowth 分别提升3倍和3.5倍。机制研究发现，E3泛素连接酶TRIM26通过调控cAMP-MAPK信号通路参与这一过程。此外，支架具备良好的生物相容性、力学稳定性及可控降解特性，为颅骨等临界尺寸骨缺损的修复提供了新策略，在口腔颌面及骨科再生领域具有潜在应用价值。

文章来源：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2025.05.011