生物3D打印心脏补片通过激活ANGPT1/Tie2通路

供稿人：韩康 贺健康 供稿单位：西安交通大学机械制造系统工程国家重点实验室


基于生物3D打印技术的新型组织工程策略已成为一种治疗动物模型中急性心肌梗死的有效方法。然而，由于移植物存活率低，生物3D打印组织的应用仍然受到限制。因此，通过精确调节包裹细胞的3D环境来提高移植物的存活率是当前研究的重点。目前，韩国高丽大学Do-Sun Lim教授团队使用人心肌细胞、人心肌成纤维细胞和明胶-甲基丙烯酰-胶原水凝胶等材料以及生物3D打印技术，制备了一种具有多孔网状结构的新型可移植3D心肌补片（cMesh）。心肌细胞和心肌成纤维细胞在补片中分布良好，且心肌细胞通过间隙连接通道相互连接促进心肌细胞成熟与交流。此外，多孔cMesh补片通过增加与细胞存活相关的mTOR、AKT和ERK信号的磷酸化来显示其结构优势。在急性心肌梗死大鼠中移植cMesh补片可改善移植物长期存活率、血管形成和稳定性、减少纤维化、增加左心室厚度和增强心脏功能。实验结果证明了多孔cMesh在急性心肌梗死动物模型中提供了结构优势和积极的治疗效果。

使用生物3D打印技术制备的cMesh补片相较于手动聚合的cPatch补片具有其独特的结构优势（图1A）。 对cPatch和cMesh补片的内外部区域细胞死亡的数量进行统计显示（图1B），cPatch组内部死亡细胞率为15%±2.44%，外部死亡细胞率为10%±0.99%。 相比之下，cMesh中的死亡细胞比例在内部区域保持在3.5%±0.82%，在外部区域为4.1%±1.61%。 基于活/死细胞活力测定的结果，进一步进行了蛋白质印迹分析以确认cMesh组和cPatch组中与细胞存活相关的mTOR、ERK和AKT蛋白的表达水平（图1C）。 结果显示，与cPatch组相比，cMesh组中的磷酸化mTOR、AKT和ERK信号表达显着增加，表明多孔cMesh补片能够显着促进移植物中细胞的存活。 利用透射电镜更详细地观察了细胞间的相互作用（图1D）。 在第0天，细胞无法相互交流。 第2天，观察到细胞铺展过程，细胞与其他细胞接触，但没有连接。 在第4日，观察到通过细胞间膜连接的细胞。 此外，与细胞膜相互作用的Cx-43和ZO-1蛋白的共表达证实了cMesh中存在结构成熟的人心肌细胞（图1E）。

图1 多孔cMesh补片具有独特的结构优势。(A) cPatch和cMesh制造示意图，包括多细胞生物墨水。(B) cPatch和cMesh的内部和外部区域示意图。对外部和内部区域的细胞进行标记，以确定活细胞（绿色）和死细胞（红色）的分布。(C) 代表性的蛋白质印迹分析定量数据显示cMesh与cPatch中mTOR、AKT和ERK的磷酸化情况。(D) 透射电镜显示cMesh内细胞的超微结构。(E) 细胞间相互作用的标志物ZO-1（绿色）和 Cx-43（红色）代表性染色图像。

为了研究多孔cMesh补片修复急性心肌梗死的细胞因子效应，与心脏重塑（MCP-1、ErbB2、MMP-9、MMP-2、TIMP-2、TIMP-1）和血管生成（PDGF-BB、SDF-1、ANGPT-1、ANG、bFGF、EGF）相关的细胞因子阵列在补片植入28天后进行检测。与第28天的假手术组和cPatch组相比，cMesh组中高度检测到ANGPT1（图2A）。同时，量化数据显示，与假手术组和cPatch组相比，cMesh 组的ANGPT1显着增强（图2B）。然而，与假手术组相比，cPatch组的ANGPT1水平没有显着差异，因此，在第7天和第28天，使用血清进行ELISA测定来估计cMesh和cPatch组中的ANGPT1的表达。cMesh组中的ANGPT1水平在第7天与cPatch组中的定量相似。相反，与cMesh组相比，cPatch中的ANGPT1水平在第28天显着降低（图2C-D）。为了定量比较cMesh和cPatch组中ANGPT-1受体Tie-2表达，通过qPCR和蛋白质印迹分析确认基因表达和蛋白质水平（图2E-G）。cMesh组Tie-2基因表达量高于cPatch组。在第28天，与cPatch组相比，cMesh组的蛋白表达水平也显着增强。基于先前与血管生成相关的ANGPT/Tie2结果，进行了免疫荧光检测以评估梗死周围区域的血管生成（图2H）。在移植cMesh和cPatch后的第28天，与假手术组相比，cMesh组和cPatch组的血管生成更显着。此外，与cPatch相比，cMesh组SMA阳性血管总数增加（图2I）。此外，将SMA阳性血管总数细分为小、中、大血管，cMesh组中大血管的比例高于cPatch和假手术组（图2J）。

图2 移植cMesh补片急性心肌梗死大鼠的心脏结构维持和血管形成通过激活ANGPT1/Tie2通路得到改善。(A-B) 假手术组、cPatch组和cMesh组裂解物的代表性心脏重塑和血管生成细胞因子阵列面板与定量分析。(C-D) ELISA测定cPatch和cMesh组中ANGPT1在第7天和第28天的含量。(E) 定量PCR检测cMesh组与cPatch组大鼠Tie2 mRNA表达水平。(F-G) cMesh组与cPatch组大鼠Tie2蛋白质印迹图像和量化数据。(H) 假手术、cPatch cMesh组中成熟血管的免疫荧光图像。(I-J) SMA阳性血管的定量分析和SMA阳性血管的比例。

这项工作结果表明，生物3D打印制备的多孔心肌补片具有适合的微环境和机械特性，能够提高细胞活力并在体内长期保留大量细胞，并且有可能提高组织再生的效率。
参考文献：

    金 KS、Joo HJ、Choi SC 等。 3D生物打印心脏网片移植通过ANGPT1/Tie2通路改善急性心肌梗死大鼠心脏功能和血管形成[J]. 生物制造, 2021, 13(4): 045014. https://doi.org/10.1088/1758-5090/acle78。