基于液滴 3D 低温生物打印技术构建自立式立体结构

来源：EFL生物3D打印与生物制造

在组织工程与再生医学领域，液滴生物打印技术因具有高分辨率、非接触式操作等优势而备受关注，但其依赖低黏度生物墨水，导致打印结构缺乏自支撑性，难以构建复杂3D立体结构，且多材料图案化需繁琐的层间交联步骤，限制了应用场景。来自哈佛医学院的Yu Shrike Zhang教授团队开发了一种液滴3D低温生物打印技术，通过将液滴打印与低温打印结合，利用低温板（-5至-15℃）使低黏度生物墨水（如7.5% GelMA）在沉积后立即冻结，无需额外支撑即可形成自立式结构，同时避免多材料混合问题。该技术成功打印出金字塔、多层网格及字母“H”“V”等单材料或多材料复杂结构，并实现了C2C12肌成纤维细胞、NIH/3T3成纤维细胞等多种细胞的封装，细胞存活率在培养2-3周后达80%-90%，还构建了血管化乳腺癌模型验证多细胞共培养潜力。相关工作以“Droplet 3D cryobioprinting for fabrication of free﹕tanding and volumetric structures”为题发表在《Aggregate》上。

研究内容
1. 液滴低温生物打印机示意图及可实现的结构示例，通过自主搭建的双微阀低温打印系统，结合压力调控（100-300 mbar）与低温板（-5至-15℃）冻结技术，研究了低黏度生物墨水（7.5% GelMA）的3D打印能力。结果表明，系统可生成1-10 nL稳定液滴，通过单/多材料喷射成功构建金字塔、多层网格及字母“H”“V”等自立式结构，验证了低温冻结对维持低黏度墨水空间形态的关键作用，避免传统液滴打印的扩散坍塌问题。   

图1. 液滴低温生物打印机示意图及可实现的结构示例。   

2. 液滴尺寸与打印高宽比量化分析图，利用光学成像系统（SmartDrop）和流变仪，研究了压力、阀门开启时间（500-700 µs）及打印频率（0.1-20 Hz）对液滴体积和结构高宽比的影响。结果显示，低压力（100 mbar）与短开启时间（500 µs）产生最小液滴（0.8 nL），低温板温度越低（如-15℃）、频率越低（如0.1 Hz），结构高宽比越高（>4），且冻结后水凝胶储存模量从室温的0.01 Pa·s跃升至50 Pa·s以上，揭示了低温通过增强材料弹性维持打印结构稳定性的机制。   

图2. 液滴低温生物打印的打印性能。   

3. 细胞封装存活率与形态演变图，通过活/死染色（Calcein-AM/PI）和免疫荧光染色（F-actin/DAPI），研究了C2C12肌细胞、NIH/3T3成纤维细胞在-5℃/-10℃打印后的存活与增殖行为。结果表明，初始存活率约50%，培养14天后升至80%-90%，细胞呈扩散生长并形成互连网络；星形胶质细胞在3%低浓度GelMA中铺展面积更大（14天达初始3倍），但结构稳定性随浓度降低而下降，提示需平衡细胞活性与力学性能。   

图3. 液滴低温生物打印C2C12和NIH/3T3细胞。   

4. 不同GelMA浓度下星形胶质细胞打印表征图，通过对比3%与7.5% GelMA浓度，研究了水凝胶刚度对星形胶质细胞行为的影响。结果显示，3% GelMA组第7天存活率（80%）显著高于7.5%组（60%），细胞覆盖面积在14天达到7.5%组的2.3倍，但低浓度水凝胶在培养后期出现轻微结构坍塌，表明软基质促进细胞铺展但需优化长期稳定性。   

图4. 不同GelMA浓度的液滴低温生物打印及细胞行为分析。   

5. 多材料空间异质性结构打印图，利用双微阀系统加载荧光染料标记的GelMA，研究了多材料分层打印的可行性。结果表明，低温冻结可防止不同材料混合，成功打印交替层状网格结构，界面清晰无扩散；进一步构建MCF-7肿瘤细胞与HUVEC血管内皮细胞的共培养模型，证明两种细胞在21天内保持空间分隔并正常增殖，验证了模拟复杂组织微环境的能力。   

图5. 液滴低温生物打印的多材料结构。   

6. 血管化乳腺癌模型共培养表征图，通过分层打印两层MCF-7细胞（2.5×10⁶ cells/mL）与两层GFP标记HUVECs（5×10⁶ cells/mL），研究了多细胞类型的空间分布与相互作用。结果显示，HUVECs在肿瘤细胞层上方形成血管样结构，培养21天后交界处可见内皮细胞向肿瘤细胞方向萌芽，两组细胞存活率分别达90%和80%，证实该技术在构建血管化肿瘤模型中的应用潜力。   

图6. 液滴低温生物打印构建的血管化乳腺癌模型。

研究结论
本研究开发了液滴3D低温生物打印技术，融合液滴打印与低温冻结，解决了传统液滴打印难以构建复杂3D自立结构的难题。系统可生成1-10 nL液滴，通过-5至-15℃低温板实现低黏度水凝胶（如7.5% GelMA）的快速固化，成功打印单/多材料立体结构（如金字塔、血管化肿瘤模型），结构高宽比最高达4以上。细胞封装实验表明，C2C12、NIH/3T3等细胞在打印后培养14天存活率达80%-90%，星形胶质细胞在3%低浓度水凝胶中铺展更佳。多材料打印证实该技术可精准控制细胞空间分布，构建的血管化乳腺癌模型中肿瘤细胞与内皮细胞保持功能活性。本研究为复杂组织工程结构和多细胞共培养模型的构建提供了新方法，但其在大尺寸结构打印和细胞长期活性调控方面仍需优化。

文章来源：
https://doi.org/10.1002/agt2.599