骨骼干细胞外泌体装备3D打印仿生支架修复骨软骨缺损

来源：EFL生物3D打印与生物制造

骨软骨缺损（OCDs）因软骨无血管特性、结构复杂性及自我修复能力有限，成为临床难题，传统间充质干细胞（MSCs）疗法受细胞异质性和免疫原性限制，修复效果不足。来自中南大学湘雅医院的吕红斌教授、曹勇副研究员利用单细胞RNA测序（ScRNA-seq）从人髌下脂肪垫（IFP）中鉴定出高软骨分化潜能的骨骼干细胞（SSCs），提取其外泌体（SSC-Exos）并负载于3D打印仿生水凝胶支架。该支架通过释放SSC-Exos中的miR-214-3p抑制JAG2信号通路，显著促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）软骨分化，在大鼠OCD模型中实现关节软骨与软骨下骨一体化再生。相关工作以“3D-printed advanced scaffold armed with exosomes derived from human skeletal stem cell identified by single-cell RNA sequencing enhances osteochondral regeneration”为题发表在《Bioactive Materials》上。

负载骨骼干细胞外泌体的仿生 3D 打印支架构建及其用于骨软骨再生的示意图。

1. 单细胞RNA测序鉴定人髌下脂肪垫骨骼干细胞亚群，通过单细胞RNA测序（ScRNA-seq）和无监督聚类分析，研究人髌下脂肪垫（IFP）及皮下脂肪组织（SAT）的细胞异质性。结果显示，IFP中存在高表达PDPN、CD73、CD164的骨骼干细胞（SSCs）亚群，其分化状态更低（CytoTRACE评分更低），软骨生成相关通路（如SOX9、COL2A1）活性显著高于SAT来源细胞，且IFP-SSCs的软骨分化潜能通过Alcian Blue染色和qPCR验证优于SAT细胞。      

图1. 通过单细胞RNA测序鉴定骨骼干细胞亚群。

2. 骨骼干细胞外泌体（SSC-Exos）的分离与功能验证，利用流式细胞术分选IFP-SSCs并提取外泌体，通过透射电镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）和Western blotting表征其形态（杯状，粒径40–160 nm）及标志物（CD81、TSG101、CD63阳性，Calnexin阴性）。功能实验表明，SSC-Exos可被骨髓间充质干细胞（BMSCs）高效摄取（PKH26标记显示红色荧光聚集于胞质），显著上调软骨分化标志物SOX9、COL2、ACAN的mRNA和蛋白表达，且其促分化效果优于脂肪间充质干细胞外泌体（ADSC-Exos）。      

图2. 骨骼干细胞外泌体的制备与表征。

3. 3D打印仿生水凝胶支架的制备与性能分析，采用紫外光固化3D打印技术构建负载SSC-Exos的GelMA支架，通过扫描电镜（SEM）观察到支架具有多孔互连结构（孔径约100–200 μm），能量色散光谱（EDS）证实外泌体均匀分布于支架内部。流变学测试显示，支架储存模量（G'）在紫外固化后稳定高于损耗模量（G''），具备剪切变稀特性；体外释放实验表明，SSC-Exos可持续释放28天，累计释放率约80%。      

图 3. 骨骼干细胞外泌体的体外软骨形成特性。

4. 支架在大鼠骨软骨缺损模型中的修复效果，在大鼠股骨滑车缺损模型中植入SSC-Exos支架，通过大体观察、micro-CT和组织学染色（H&E、Safranin O/Fast Green、Masson’s Trichrome）评估修复效果。结果显示，术后8周时，SSC-Exos支架组缺损被新生透明软骨样组织完全填充，软骨下骨骨体积/总体积（BV/TV）和骨小梁数量（Tb.N）显著高于对照组（*P < 0.001*），且免疫组化显示COL II和ACAN表达接近正常软骨水平。      

图4. 负载骨骼干细胞外泌体的3D打印仿生水凝胶支架的表征。   

5. miR-214-3p/JAG2信号轴调控机制研究，通过miRNA测序筛选出SSC-Exos中高表达的miR-214-3p，荧光素酶报告实验证实其直接靶向JAG2 mRNA的3'非翻译区（3'UTR）。功能缺失实验显示，抑制miR-214-3p（miR-214-3pIN-Exos）可减弱SSC-Exos对BMSCs的促软骨分化作用，而JAG2过表达则逆转该效应，提示miR-214-3p通过抑制Notch信号通路配体JAG2，促进BMSCs向软骨细胞分化。   

图5. 外泌体的体内释放及修复后骨软骨缺损的成像分析。

6. 组织修复的长期安全性与免疫原性评估，通过H&E染色观察心、肝、脾、肺、肾等主要器官，结果显示SSC-Exos支架组无明显炎症细胞浸润或组织损伤，证实支架具有良好的生物相容性和低免疫原性。此外，长期跟踪（8周）未观察到肿瘤形成或异常组织增殖。      

图6. 术后4周和8周时不同组修复组织的组织学评估。

研究结论
本研究开发了一种基于单细胞RNA测序筛选的人髌下脂肪垫骨骼干细胞外泌体（SSC-Exos）负载3D打印仿生水凝胶支架的骨软骨再生策略。通过调控miR-214-3p/JAG2信号轴，SSC-Exos显著促进骨髓间充质干细胞软骨分化，其搭载的3D支架通过多孔结构实现外泌体持续释放，在大鼠骨软骨缺损模型中实现了关节软骨与软骨下骨的一体化再生。组织学和影像学结果显示，术后8周修复组织接近正常结构，软骨特异性标志物COL II和ACAN表达显著上调。该系统结合外泌体的生物活性与3D打印的定制化优势，为骨软骨缺损提供了无细胞、高安全性的修复方案，其多通道调控机制有望为再生医学领域提供新的思路。

文章来源：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2025.04.028