预血管化骨类器官的 3D 生物打印用于快速原位颅骨修复研究进展

来源：EFL生物3D打印与生物制造

颅骨缺损，尤其是关键尺寸的颅骨缺损，因其自身再生能力有限，存在愈合时间长、再生不完全及骨不连风险高等问题。当前临床修复手段如金属植入物、同种异体移植物和人工移植物等，面临供体有限、存在疾病传播风险及修复效果不理想等挑战。传统骨组织工程的“自上而下”方法（细胞接种于生物材料支架）存在细胞分布不均、营养扩散不足、支架降解困难等缺陷，且难以复制骨骼复杂结构，同时干细胞聚集体体外成骨诱导时间长、血管化不足，限制了快速原位成骨。  

为解决上述问题，清华大学熊卓、方永聪课题组与北京协和医学院杨斌课题组合作，提出一种新型发育工程策略，将间充质干细胞（MSCs）、人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与成骨微颗粒结合，大规模构建具有自组织血管化和成骨特性的预血管化骨类器官。团队系统筛选出石墨烯氧化物（GO）作为最优成骨微颗粒，其通过粘着斑和PI3K/Akt通路显著促进成骨分化。进一步将类器官负载于明胶甲基丙烯酰酯（GelMA）水凝胶中进行3D生物打印，构建具有高细胞密度和成骨能力的复杂组织构建体。体内实验证实，该方法可促进快速血管化骨组织形成，实现颅骨缺损的有效原位再生修复。  

相关工作以“3D Bioprinting of Prevascularized Bone Organoids for Rapid In Situ Cranial Bone Reconstruction”为题发表在《Advanced Healthcare Materials》上。北京协和医学院2022级整形外科博士生段婧为第一作者，清华大学熊卓教授、方永聪助理教授及协和医学院杨斌教授为共同通讯作者。

1. 研究设计与实验流程示意图。通过示意图展示研究整体设计及实验流程，研究对象为预血管化骨类器官的构建及其在颅骨修复中的应用。结果表明，结合间充质干细胞、内皮细胞与成骨微颗粒（如石墨烯氧化物）的预血管化骨类器官，经3D生物打印后可促进原位血管化骨再生，为颅骨缺损修复提供新策略。      

图1. 预血管化骨类器官研究设计及实验流程示意图。   

2. 预血管化成骨聚集体的表征与优化。采用强制聚集技术制备含不同成骨微颗粒（羟基磷灰石、生物玻璃、石墨烯氧化物等）的细胞聚集体，通过实时定量PCR、免疫荧光染色等方法评估成骨基因表达与细胞活性。结果表明，石墨烯氧化物（GO）组的成骨相关基因（如ALP、COL-1、Runx-2）表达显著高于其他组，且细胞相容性良好，证实GO对成骨分化的促进作用最优。      

图2. 预血管化成骨聚集体的表征与优化。   

3. 负载GO的预血管化骨类器官的成骨与血管化评估。利用碱性磷酸酶染色、茜素红染色及血管生成实验，研究GO负载的预血管化骨类器官的成骨矿化能力与血管网络形成。结果表明，GO促进钙沉积与成骨分化，且含内皮细胞的聚集体可自组织形成毛细血管样结构，CD31表达证实血管化能力，说明该类器官兼具成骨与血管化特性。      

图3. GO负载预血管化骨类器官的成骨与血管化特性。   

4. GO促进成骨分化的分子机制转录组分析。通过mRNA测序与生物信息学分析，研究GO影响成骨的分子通路。结果显示，GO组差异表达基因富集于粘着斑、PI3K/Akt信号通路等，Western blot验证PI3K、AKT等蛋白表达上调，证实GO通过激活粘着斑和PI3K/Akt通路促进成骨分化与细胞外基质合成。      

图4. 预血管化骨类器官的转录组分析与机制探究。   

5. 预血管化骨类器官的3D生物打印工艺与性能。选用7.5 wt.% GelMA水凝胶作为生物墨水载体，通过流变学测试优化打印参数，结合活/死染色评估细胞 viability。结果表明，打印结构具有良好的挤出稳定性与细胞活性（ viability ≈85.63%），且内皮细胞可形成血管网络，证实3D打印技术可实现类器官的规模化构建与功能保留。      

图5. 预血管化骨类器官负载生物墨水的3D生物打印。   

6. 颅骨缺损修复的体内效果评估。在大鼠颅骨缺损模型中植入不同处理的生物打印 construct，通过显微CT、组织学染色（H&E、Masson三色）及免疫荧光染色评估骨再生与血管化。结果表明，含GO与内皮细胞的预血管化骨类器官组（M+H+GO）新骨覆盖率、骨体积分数（BV/TV=32.28±4.48%）及血管密度显著高于其他组，且促进M2型巨噬细胞极化，证实其高效的原位骨再生与抗炎能力。      

图6. 预血管化骨类器官修复颅骨缺损的体内评估。   

7. 血管化与免疫响应评估。利用磁共振成像（MRI）与免疫荧光染色，分析缺损区域的血管网络形成与巨噬细胞极化。结果显示，预血管化组（M+H、M+H+GO）血管体积显著大于对照组，且GO负载组CD163+（M2型）巨噬细胞比例升高，表明预血管化骨类器官通过增强血管化与免疫调节促进骨再生。      

图7. 颅骨缺损修复的血管化与免疫响应分析。

研究结论
本研究提出一种结合预血管化骨类器官与3D生物打印的新策略，用于快速原位颅骨再生。通过将间充质干细胞、内皮细胞与成骨微颗粒（如石墨烯氧化物）整合，构建了具有自组织血管化能力和增强成骨特性的类器官。3D生物打印技术将类器官负载于水凝胶中，形成定制化的大型骨移植物，实现了接近生理细胞密度的血管化骨组织构建。体内实验显示，该方法通过激活粘着斑和PI3K/Akt通路促进成骨分化，并通过内皮细胞自组装形成血管网络，显著加速颅骨缺损的原位骨形成，同时诱导抗炎性M2巨噬细胞极化。研究结果表明，这种发育工程策略克服了传统支架方法的局限性，为骨再生提供了可扩展的有效途径，有望推动生物制造和组织工程在临床再生治疗中的应用。


文章来源：
https://advanced.onlinelibrary.w ... 1002/adhm.202501376