如何利用功能性墨水设计和生物3D打印技术来实现半月板损伤修复?

3D打印动态
2024
04/22
10:15
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来源: EngineeringForLife

半月板损伤是运动医学领域面临的一大挑战,常因膝关节受力分布异常、润滑降低及稳定性下降导致软骨退化,最终可能发展为骨关节炎。由于半月板自愈能力弱,修复难度大,现有治疗如移植、切除或缝合术无法根本阻止疾病进程。这突显出寻找有效治疗手段的紧迫性。随着组织工程技术的发展,为半月板损伤的修复与重建提供了新的思路,尤其是在复制半月板自然异质性方面的探索,成为当前研究的重点。

本期,EFL以发表在杂志《Chemical Engineering Journal》上的“Regional specific tunable meniscus decellularized extracellular matrix (MdECM) reinforced bioink promotes anistropic meniscus regeneration”研究为例,介绍了3D打印技术结合复合型墨水构建,可制备具有分区微结构的支架,以促进半月板再生和软骨保护。该支架模拟了半月板的自然异质性,通过特定区域的细胞分化和外基质沉积,实现了各自区域功能的显著增强,促进了各向异性的半月板再生,表明该方法在运动医学领域中具有潜在的应用价值。

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1. 本文生物墨水是如何制备的?

➢ GelMA/HAMA水凝胶的配制

利用10%(w/v)的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)和2%(w/v)的甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)配制光交联水凝胶:将GelMA粉末溶于磷酸盐缓冲液(PBS)并加热至完全溶解,随后加入HAMA粉末和0.5%(w/v)的光引发剂(LAP),混合均匀。


➢ MdECM整合与生物活性因子添加
将半月板脱细胞外基质(MdECM)粉末以2%(w/v)的比例加入到GelMA/HAMA混合物中,以实现区域特定的细胞诱导。为了进一步促进特定区域的细胞分化,向内部区域的生物墨水中添加10 ng/mL的转化生长因子β3(TGF-β3),向外部区域的生物墨水中添加100 ng/mL的结缔组织生长因子(CTGF)。

➢ 生物墨水的优化
通过调整GelMA和HAMA的比例、MdECM的加入量、以及生物活性因子的浓度,优化生物墨水的物理和化学性质。这些参数的精确控制,旨在提高生物墨水的凝胶化性能、粘度和最终构件的机械强度,以适应不同的三维打印需求和生物学应用。

2. 如何利用载缺氧预处理的软骨祖细胞的GelMA微球治疗骨关节炎?

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图1 本文的研究示意图


1)光交联生物墨水的制备与表征
本文首先从猪半月板中成功提取了区域特定的MdECM。实验对半月板内外区域进行了分离和脱细胞处理,旨在去除细胞成分同时保留外基质结构和重要成分如胶原蛋白和糖胺聚糖(GAGs)。随后,通过冻干和研磨过程,将处理后的组织转化为细小的MdECM粉末。该过程不仅验证了脱细胞方法的有效性,还确保了保留了半月板内外区域的生物化学特性和生物活性,为后续生物墨水的制备和半月板组织工程的应用奠定了基础。

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图2 区域特异性的MdECM制备和表征


2)区域特异性MdECM生物油墨的制备与表征
作者基于MdECM开发了一种模拟半月板自然异质性的生物墨水。通过将来自半月板内外不同区域的MdECM与GelMA和HAMA水凝胶结合,制备了四种不同浓度的MdECM基生物墨水(G10H0, G10H1, G10H2, 和G10H3),旨在发现最适合细胞生长和精确3D打印的配比。不同配比的水凝胶在紫外线照射下30秒内能够快速凝胶化,且随着MdECM的加入,墨水由透明转为不透明,这一变化可能有助于提高细胞附着和生长。通过FTIR分析,确认了生物墨水中GH和MdECM成分的均一性和结构稳定性,特别是在870 cm-1处观察到的C-OH键伸展峰,表明了成功的材料混合。

流变学性质的评估表明,所有生物墨水都展现出剪切稀化行为,这对于通过3D打印技术精确构建支架结构极为重要。特别地,G10H3组表现出更高的弹性模量,指示其可能更适合支撑细胞生长的结构。此外,CTGF和TGF-β3的缓慢且持续的释放曲线强调了这些生物墨水能够长时间在细胞微环境中提供生长因子,促进特定类型的细胞分化。通过对支架的微观结构设计,模拟了半月板的自然微结构,其中外部区域的纤维设计为松散和大孔径,而内部区域的纤维紧密且孔径较小,有助于模拟半月板内外不同区域的物理和生物功能。

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图3 区域特异性MdECM生物墨水的表征


3)区域特异性生物墨水增强支架的生物学评价
作者进行了区域特异性生物墨水增强支架的生物学评价。细胞活力测试的结果显示,无论是外部还是内部区域的生物墨水,都没有显示出细胞毒性,证明了这些生物模拟生物墨水具有满意的细胞相容性。为了成功复制半月板的自然形态和各向异性结构,向细胞环境中提供适当的信号,包括生化刺激,是至关重要的。研究发现,TGF-β3能够提高软骨基因(如COL2A1、ACAN和SOX9)的表达水平,而CTGF能够在正确刺激下增加纤维软骨基因(如COL1A1、FN1和TNC)的表达水平。此外,通过组织特异性荧光标记的分析显示,与对照组(PG组)相比,PGEF组在内部区域展现了更高水平的II型胶原(Col II)表达,在外部区域展现了更高水平的I型胶原(Col-I)表达。实时定量聚合酶链反应(q-PCR)的结果进一步证明了在PGEF组中,无论是软骨基因(COL II、ACAN和SOX 9)还是纤维生成基因(COL I、FN1和TNC)的表达都显著高于对应的对照组。结果表明,所开发的生物模拟水凝胶具有明显的组织特异性调节活动,能够成功模拟软骨和纤维生成微环境。因此,PGEF被证实具有诱导间充质干细胞进行各向异性纤维软骨分化以及体外特定区域细胞外基质生成的能力。

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图4 区域特异性生物墨水增强支架的生物相容性


4)评价再生半月板对软骨的保护作用
➀体内再生半月板的宏观观察、MRI和生物力学评价
该研究进行了半月板再生的评估,在将特定区域的MdECM增强构造体植入兔膝关节后进行的。通过使用MRI分析在冠状面和矢状面上评估各个组中的组织形态生成。结果显示,在24周时所有组都可见到新生半月板,PGEF组显示的再生组织在形状和轮廓上更接近自然半月板。此外,PGEF组的WORMS评分显著低于其他组,类似于自然半月板,从而突显出PGEF支架的卓越再生效果。再生构造体的一般形态在24周后展现,其中PGEF组展示了更完整、更均匀的再生半月板,与关节整合性更好。

为了评估力学的各向异性,进行了各种拉伸测试,包括内外区域的径向和周向的减小和双向拉伸测试,并分析了前角和后角的最终拉伸强度。在进行了24周的体内测试后,观察到PGEF组展现了特定区域(内部与外部)在周向拉伸模量和减少模量方面的差异。然而,就减少模量和双向拉伸模量而言,PGEF组与自然组在两个区域之间不再存在差异。此外,PGEF组的径向拉伸和最终拉伸强度超过了对照组,更类似于自然组。
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图5 体内再生半月板的宏观观察、MRI和生物力学评价


➁体内再生半月板的组织学评价
进一步实验表明,PGEF组的组织学评估显示了更具区域特异性的细胞表型和细胞外基质沉积分布,这与自然半月板非常相似。内部区域展示了由COL-2和蛋白多糖组成的软骨基质,而外部区域显示了以COL-1为特征的排列有序的纤维基质。半定量研究和免疫组化揭示了从外部区域到内部区域COL 1的强度降低,而COL 2的强度相应增加。这种生化组成与自然半月板相似,其中外部区域主要是COL-1,而内部区域的胶原蛋白大部分是COL 2。PGEF组再生的半月板组织的组织学结果显示了特定区域的细胞表型,类似于自然半月板的ECM的各向异性组织,相比之下,对照组没有显示出差异性的细胞结构。此外,PGEF组的内部区域有许多球形的软骨细胞样细胞,而外部区域则以梭形的成纤维细胞样细胞为主,从而类似于半月板的自然结构。

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图6 体内再生半月板的组织学评价


5)区域特异性MdECM基半月板增强结构对软骨的保护作用
同时,研究也讨论了再生半月板对软骨的保护效果。通过对关节软骨的整体观察,与其他组相比,PGEF组在每个时间点上显示出较少的软骨退化,这一点也得到了组织学检查的支持。具体来说,在对照组中,股骨髁和胫骨平台的关节软骨显示出相当大的失序,并在甲苯胺蓝染色和SO染色中显现浅色。根据国际软骨修复学会(ICRS)评分和曼金斯评分,对照组的软骨损伤更为严重。相反,PGEF组展示出比对照组更优越的软骨保护能力,根据组织学染色,PGEF组中没有明显的软骨退化和裂缝。这些发现表明,特定区域的MdECM增强支架不仅实现了生物功能的各向异性仿生学,而且还促进了机械恢复。

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图7 体内软骨的组织学评估


3. 本文的创新点
本研究的主要创新在于开发了一种基于区域特定脱细胞外基质(MdECM)的生物墨水,结合GelMA和HAMA水凝胶制备过程。这种生物墨水不仅模拟了半月板的自然异质性,而且通过精确控制生物活性因子TGF-β3和CTGF的释放,创新地促进了特定区域细胞的特化分化。此外,研究首次利用三维打印技术与MdECM相结合,精确构建了模拟自然半月板结构和功能的组织工程支架,为复杂组织的再生和修复提供了新策略。

4. 总结
本研究成功证明了MdECM基GelMA/HAMA生物墨水在模拟半月板自然异质性和促进特定细胞分化方面的有效性。通过结构稳定性和打印性能的优异表现,以及生物活性因子的长期稳定释放,这种生物墨水为半月板损伤的修复和再生医学领域提供了有力的材料基础。体外实验进一步验证了其在促进细胞特定类型分化和组织再生方面的潜力,展示了利用三维打印技术精确构建半月板组织工程支架的前景。

文献来源:
https://doi.org/10.1016/j.cej.2023.145209



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