纳米粒子也能治疗癌症？姜黄素结合3D肿瘤模型给出肯定答案

来源： EngineeringForLife

与传统治疗方法相比，纳米药物因其具有更好的靶向性、更高的给药效率和良好的水溶性而引起越来越多的关注。然而，传统的药物疗效评估方法是基于单细胞的2D培养方法来获得体外治疗效果，这可能不能代表实际肿瘤。基于上述考虑，3D细胞培养模型成为更好的选择，因为它们可以增加体外系统的复杂性，并提供比2D培养更接近体内原生的仿生微环境。

为此，来自大连理工大学的宋克东研究员将聚合非离子表面活性剂(Pluronic F127)与姜黄素结合，制备了水溶性好、治疗肿瘤效果好的姜黄素纳米颗粒(CurNPs)（图1）。以纳米粘土、海藻酸钠和明胶为基础制备的杂化支架具有良好的印刷相容性和良好的生物相容性。之后使用支架结合的转移性乳腺癌(MDA-MB-231)细胞构建3D肿瘤模型，研究了CurNPs对转移性乳腺癌的治疗作用（图1）。相关研究成果以“Curcumin nanoparticles combined with 3D printed bionic tumor models for breast cancer treatment”为题于2022年12月8日发表在《Biofabrication》上。

图1 CurNPs联合3D打印Gel/Alg/NC支架治疗乳腺癌肿瘤示意图

1. CurNPs的制备及其性能特征
首先，作者以姜黄素(Cur)和Pluronic F-127 (PF127)为原料采用纳米沉淀法制备了姜黄素纳米颗粒(CurNPs)。通过各种理化表征对CurNPs的性质进行了特异性分析，并通过体外药物筛选，研究了CurNPs在二维环境下对乳腺癌细胞(MDA-MB-231)和正常细胞(L929)的细胞毒性。（图2）。

图2 CurNPs的生物毒性试验

2. 生物墨水的特征
在二维环境下的单细胞研究无法模拟体内微环境的固有细胞组成和行为特征，从而限制了其体外和体内效应之间的精确对应因此，为了更好地模拟体内肿瘤微环境，作者对具有良好生物相容性和流变性能的3D打印Gel/Alg/NC支架进行了研究。

将海藻酸盐/明胶前驱体溶液中加入纳米粘土（NC）作为打印支撑材料，在超纯水中按5:4:1的质量分数比(Gel:NC:Alg)制备得到的油墨粘性更大（图4a左）。流变结果表明所制备的油墨具有良好的剪切减薄性能和良好的印刷适性。油墨之间存在较强的相互作用力，这为印刷后的形状保持奠定了良好的理论基础。此外，油墨的触变性表征了流体粘度对时间的依赖关系。还测量了剪切应力随剪切速率的变化，结果表明，剪切应力-剪切速率曲线的面积较大，说明油墨的触变性大，稳定性高，不易变形（图3）。

图3 Gel/Alg/NC油墨的流变性能测试

由此打印出的支架结构平整，具有良好的支撑性能，不易倒塌（图4a右）。利用扫描电镜可以更直观地观察到钙离子交联和EDC/NHS/MES二次交联后3D打印支架的微观形貌。从图6b可以发现，交联后的支架孔隙明显，表面不规则且粗糙(图4c)，这为细胞的粘附奠定了基础。EDS进一步说明了支架的组成成分，接触角的降低说明支架的亲水性良好更有利于细胞的粘附。

图4 三维Gel/Alg/NC支架的物理性能表征

3. CurNPs在三维肿瘤模型/环境中的细胞毒性试验及其作用机制
良好的生物相容性是建立肿瘤模型的先决条件。本研究首先采用活/死染色和CCK-8法检测支架上L929细胞和MDA-MB-231细胞的增殖情况，为肿瘤模型的构建奠定基础。结果表明3D打印Gel/Alg/NC杂化支架中L929细胞和MDA-MB-231细胞的增殖活性均较好，两组间增殖能力无明显差异。说明所制备的Gel/Alg/NC杂化支架具有良好的生物相容性，均能促进成年正常细胞(L929)和乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的粘附和增殖(（图5）。

图5 三维Gel/Alg/NC复合支架细胞增殖试验

此外，作者还对CurNPs在三维肿瘤模型/环境中的细胞毒性进行了试验。对于用CurNPs处理的肿瘤模型，如图6所示，随着时间的增加，加入CurNPs后，绿色荧光逐渐减少，表明活细胞数量逐渐减少，而红色荧光逐渐增加，表明死亡细胞数量逐渐增加。在CurNPs处理的2D孔板中培养的细胞在24小时内达到了约90%的细胞死亡率。

图6 CurNPs在3D Gel/Alg/NC杂化支架上的细胞毒性测试

接下来，作者通过3D Gel/Alg/NC支架的H&E染色进一步研究了CurNPs对3D培养的MDA-MB-231细胞的杀伤作用(图7)。从H&E染色结果可以看出，CurNPs处理4天后，空白对照组的大部分细胞呈球形聚集状态。而CurNPs组的细胞数量较未处理的空白对照组更为稀疏和分散，且大部分细胞核可见断裂，导致染色效果较差。上述结果表明，CurNPs能够抑制3D Gel/Alg/NC支架培养的MDA-MB-231细胞，具有良好的细胞毒性（图7）。

图7 H&E染色分析CurNPs对3D肿瘤模型MDA-MB-231的影响

接下来，作者进一步在3D支架上通过免疫荧光检测MDA-MB-231细胞中凋亡蛋白(Bcl-2和Bax)的表达，探讨CurNPs对肿瘤模型的作用机制。与对照组相比，三维支架肿瘤模型中MDA-MB-231细胞的Bcl-2荧光(488 nm和594 nm)表达在CurNPs处理4 d后显著降低(P < 0.001)。定量分析显示Bcl-2荧光强度明显低于对照组，表明CurNPs可以抑制Bcl-2的表达（图8a-b）。然后分析细胞凋亡促进因子Bax的表达，CurNPs处理的三维肿瘤模型显示出明显的荧光增强，表明CurNPs可以上调支架内MDA-MB231细胞中Bax的表达（图8c-d）。上述结果表明，CurNPs可以通过改变3D肿瘤模型MDA-MB-231细胞中凋亡相关蛋白的表达来促进细胞凋亡。

图8 CurNPs处理的3D Gel/Alg/NC支架的免疫荧光分析

4. CurNPs和3D打印Gel/Alg/NC支架的生物安全性评价
最后，作者通过溶血实验评估了CurNPs和3D Gel/Alg/NC支架的体内血液相容性。结果表明在CurNPs和3D支架中均没有溶血现象（图9a-b）。作者又分别在96孔板中取出100μl溶血样品，在570 nm波长下，每个样品平行检测3个，计算溶血率，结果如图9c-d所示，实验组溶血率接近0%，与图9a-b结果一致，进一步证明了CurNPs和3D Gel/Alg/NC支架均具有良好的血液相容性和生物安全性。

图9 CurNPs与3D Gel/Alg/NC支架的血液相容性研究

综上，本文通过简单的纳米沉淀法成功制备了一种纳米治疗药物CurNPs，所制备的CurNPs具有良好的生物相容性、满足的水溶性、良好的发光性、通过EPR效应有效的细胞内食以及有效的肿瘤治疗效果等优点。此外，通过简单的合成方法建立了具有良好力学和流变学性能的体外支架肿瘤模型，并通过CCK8、活/死细胞染色、SEM等方法验证了该三维支架能够更好地模拟体内肿瘤微环境，能够较好地代表实际肿瘤，从而更准确地进行体外药物筛选。基于上述分析，本研究为构建多功能纳米药物体外药物筛选多平台开辟了新途径。

文章来源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/aca5b8