北京协和毛一雷教授团队和马文彬教授团队发表: 3D 生物打印矩阵...

3D3D18(E18)(GelMA)3D neuMatrix3D neuMatrixE18/(MCAO/R)大鼠模型的存活状态、功能特征及转录组特性。这些发现证实了3D neuMatrix内多尺度神经回路的形成，展现了其在神经发育研究、疾病建模与药物筛选及体外智能研究领域的宝贵潜力。
一、背景介绍：
大脑作为高度复杂的器官，其原代神经细胞模型对神经科学研究至关重要。传统2D培养缺乏三维结构和细胞外基质(ECM)刺激，限制了神经网络形成。而3D支架、类器官等模型虽部分解决该问题，但仍存在细胞活力低或结构调控不足等局限。3D生物打印技术凭借高通量、设计自由度高的优势，成为构建功能性神经组织的新途径。基于挤出的生物打印可精准控制细胞分布如皮层神经元分层、轴突方向性，但原代神经细胞对剪切力敏感，需优化打印参数与生物墨水。本研究选用生物相容性良好的明胶甲基丙烯酰(GelMA)，结合既往打印功能性肝组织的经验，减少细胞损伤，促进突触连接形成。

最终构建的3D neuMatrix是新型3D生物打印原代神经组织，具备复杂的局部与规模功能性神经网络。通过单细胞测序和转录组分析证实，其在生理/病理状态下均能高保真重现大脑皮层的细胞亚型与神经发育动态，为神经回路研究、疾病建模、药物筛选及体外智能领域提供了创新平台(图1a)。

图1. 3D neuMatrix的构建流程。

二、材料和方法

2.1 原代皮层神经元的3D生物打印

将混合后的生物墨水转移至装有21G针头的灭菌注射器中，装入3D生物打印机，并预设温度。对喷嘴和成型室温度进行微调，以确定在打印过程中保持最高细胞存活率的理想条件。生物打印过程使用基于挤出的生物打印机(SUNP BIOTECH公司的BioMaker 系列生物3D打印机)，遵循先前建立的方案。简而言之，3D neuMatrix的整体形状设计为立方体，框架间设有独立通道，可最大化原代神经细胞与培养基的接触面积。通过3D生物打印机在24孔板的各孔内以逐层挤出的方式连续制备 3D neuMatrix。打印速度设置为4.8 mm s-1，挤出速度设置为1.5 mm³ s-1。

随后，3D neuMatrix经7.5 mW/cm-2的405 nm光照射10秒以促进交联，之后加入1 mL完全培养基，在37°C、5% CO₂条件下培养。整个生物打印过程耗时约1小时。神经元成熟通过体外培养7天诱导，每2天更换一半培养基，随后进行后续评估。

三、结果

3.1 3D neuMatrix 的关键生物学特性

将E18大鼠原代皮质细胞与GelMA、光引发剂按1.5×10⁷ cells/mL密度混合，采用21G 喷嘴(内径510 μm)挤出打印，经405 nm光(7.5 mW/cm²)交联10秒，构建7×7×1.5 mm 含500 μm互连通道的6层结构。优化后的参数减少了剪切力损伤，且可通过自修复水凝胶浴实现微型大脑等复杂结构的浮动打印(图1b)。细胞活力在DIV 7达峰值(299±20%)，28天培养仍保持活性。HE染色和SEM显示，细胞在多孔水凝胶中形成直径超200 μm的簇，神经突相互连接，而2D培养细胞分布随机(图1c-g)。该模型通过生物墨水与打印工艺优化，实现了原代神经细胞的高活性三维封装。

3.2 3D neuMatrix 中的多尺度神经网络

体外培养期间，细胞簇体积显著增长，前3天扩大3倍(8408 μm3增至30215 μm3)(图2a,b)。Ki67阳性细胞数在DIV4达峰(42.8±5.6个/ROI)，DIV7降至25.5±4.3个/ROI，与体积增长和整体活力趋势一致(图2c)。细胞簇主要由成熟的NeuN阳性神经元组成，富含MAP2阳性突起和深染的SYN(表明丰富突触)。Nestin阳性干细胞极少。尽管未主动筛选，GFAP阳性星形胶质细胞数量少于神经元，并在神经簇内形成沿神经突起延伸的支架样结构(图2d,e)。Imaris重建显示，局部尺度上相邻簇间存在复杂多分支神经突起网络(图2f)。毫米尺度上，整个3D neuMatrix形成了高度类似体内大脑枢纽和投射结构的三维神经网(图2g)。

图2. 3D neuMatrix中独特的神经网络结构。

3.3 3D neuMatrix 的功能连接与药物响应性

利用Fluo-4 AM可视化钙振荡，评估3D neuMatrix的神经功能。微观层面，簇内神经元独立振荡并间歇性协调放电。介观尺度下，神经簇可分为5组，组内钙放电高度同步，相距2 mm的簇组间也存在同步放电，证实其形成大规模功能性神经网络(图3a-e)。分析 DIV1-14的钙信号发现，平均放电率、检测到钙放电的簇百分比随培养时间上升，DIV 14略有下降，与细胞活力趋势一致。全局平均相关性持续增加。综合考虑，选择DIV 7为后续研究时间点(图3f - h)。通过神经递质受体拮抗剂处理探究小分子影响，抑制GABA受体(BIC、PTX)显著提升放电率，抑制谷氨酸受体(NBQX、AP5)则降低放电率；除AP5外，其余处理后全局平均相关性下降。该结果表明，兴奋性与抑制性神经元共同参与网络形成，二者平衡维持同步性，且3D neuMatrix对小分子的功能响应特性，使其适用于CNS疾病建模与药物筛选(图3i - l)。

图3. 3D neuMatrix神经网络的功能动态特性。

3.4 3D neuMatrix 中皮层转录组谱的重建

为验证3D生物打印神经组织的转录保真度，对2D培养神经元、3D neuMatrix和E18大鼠皮层进行RNA-seq分析。PCA显示3D neuMatrix与E18皮层的全局转录谱相关性显著高于2D培养(图4a,b)。通过差异基因(DEGs)分析，3D neuMatrix中E18皮层特征性上调/下调基因的富集分数分别为0.41和-0.39，显著优于2D培养(图4c-f)。GO和KEGG分析表明，3D neuMatrix激活细胞互作、ECM组织等通路，而2D培养富集钙信号及神经退行性相关通路(图4g-i)。GSVA进一步证实3D neuMatrix与E18皮层的通路富集模式更接近，尤其在神经元投射和突触传递等特征上(图4j)。对关键基因子集的分析显示，3D neuMatrix在神经元突触、ECM-受体互作等通路更贴近E18皮层，而大脑皮层特有的神经发育调控通路在体外模型中富集度较低。综上，3D neuMatrix在分子层面高度重现体内神经组织特征，具备优异的生物学保真度。

图4.基于RNA测序验证3D neuMatrix的基因表达保真度。

3.5 3D neuMatrix 对大脑皮层细胞组成的重现

为探究3D neuMatrix的细胞组成及时序动态，在DIV 1和DIV 7开展snRNA-seq(图 5a,b)，获取36304个细胞并完成类型注释(图5a,c,d)。UMAP分析显示神经亚群分布与体内皮层神经元分层一致，与大鼠皮层数据合并后分类稳定，细胞类型比例也与体内高度吻合，证实其精准重现大脑皮层细胞组成。

培养期间的细胞组成符合体内发育趋势(图5e)，尤其是神经胶质细胞。DIV7时神经前体细胞(NPC)从8.24 %降至1.61 %，星形胶质细胞(ASC)和少突胶质细胞(ODC)分别增至 13.86 %和3.98 %。兴奋性神经元(EN)比例从46.64 %降至22.34 %，抑制性神经元(IN)稳定在22.9%左右，与钙振荡同步性增加一致。细胞周期分析表明DIV7时细胞分裂能力减弱。(图5b,e,f)。

伪时间分析显示，神经元呈现从未成熟神经元(IMN)到分化神经元的发育轨迹。IMN高表达放射状胶质细胞标志物(Fabp7、Vim)，兼具泛神经元特征但缺乏成熟标志物，可能从分裂状态转变为休眠状态；成熟神经元的神经投射和递质分泌功能随时间显著增强，突触组装富集度维持较高水平(图5g-j)。

图5. DIV 1和DIV 7时3D neuMatrix的单细胞核RNA测序(snRNA-seq)分析。

3.6利用3D neuMatrix构建缺血性中风模型

为评估3D neuMatrix在疾病建模与药物筛选中的潜力，以缺血性中风为模型，通过氧-葡萄糖剥夺/再灌注(OGD/R)处理发现，OGD 4小时后细胞活力降至49.0±0.6%，钙振荡的放电速率和放电细胞百分比显著降低，全局相关性呈上升趋势(图 6a-e)。转录组分析显示，3D neuMatrix的OGD/R模型与大鼠MCAO/R模型的转录特征更吻合，其上调的缺氧响应、ECM相互作用等通路，较2D培养更准确模拟了缺血性中风的神经组织损伤机制(图6f-m)。药物筛选实验中，依达拉奉和丁苯酞未能改善OGD/R后的细胞活力与功能，可能因4小时 OGD已造成不可逆损伤。综上，3D neuMatrix在神经疾病建模和药物研发中展现出独特优势，为体外研究提供了更贴近体内环境的平台。

图6. 3D neuMatrix的OGD/R建模与缺血性中风特征重现。

四、讨论

利用3D生物打印技术构建了体外神经模型3D neuMatrix，该模型仅需7天即可形成具有多尺度功能连接的复杂可重现神经网络。其钙信号特征与大脑皮层功能架构相似，基因表达谱比2D培养更贴近E18皮层，且通过单细胞测序证实可重现大脑皮层细胞组成及发育动态，为神经环路机制、CNS疾病机制、药物筛选及组织工程研究提供了有价值的体外平台。

相比传统2D培养和其他3D建模方法，3D neuMatrix在高通量构建、可重复性及神经网络空间组织精度上优势显著。它优化了原代皮层细胞的生物打印流程，避免了iPSC衍生神经元成熟度不足的问题，能构建多种高保真CNS模型；其展现的多尺度功能性神经连接源于3D生物打印的预设空间cues，结合可扩展性有望用于神经组织修复与生物计算；在疾病建模方面，可高通量筛选药物，结合基因编辑技术能模拟多种神经退行性疾病。

该模型也存在一定局限性，如生物墨水基于明胶无法完全重现大脑ECM，打印过程可能造成剪切力损伤，培养期间细胞簇增大可能引发缺氧反应，且缺乏血管化结构影响病理模拟完整性。未来需通过优化生物墨水、引入新兴生物制造技术及构建血管化结构等方式提升模型的生理模拟真实性。

五、结论

综上，利用3D生物打印技术构建了体外神经组织3D neuMatrix，其具有明确的细胞组成、神经环路及可调控的空间组织。单细胞分析显示，体外培养期间神经元亚型和神经胶质细胞分化，神经通讯相关基因表达上调。通过3D neuMatrix进行的疾病建模证实，其有望为CNS疾病的发病机制和治疗研究提供更贴近生理的模型。

六 、参考文献

H. Yang, J. Zhang, Y. Li, Z. Zhong, W. Li, H. Luo, Y. Liu, L. Ouyang, Z.Jiang, Y. Sun, H. Sun, L. Liu, H. Yang, Y. Wang, N. Yang, W. Ma, Y. Mao,Multiscale Organization of Neural Networks in a 3D Bioprinted Matrix. Adv. Sci.2025, e04455.