体积生物3D打印秒速构建异细胞类骨组织

来源：EFL生物3D打印与生物制造

在组织工程和再生医学领域，研发能模拟生理组织结构和功能的三维细胞构建体意义重大，3D打印与模拟细胞外基质的材料相结合推动了该领域发展，但传统基于逐层沉积的3D生物打印技术存在打印时间长、支架孔隙率和构建体尺寸难以满足临床需求等问题。  

苏黎世联邦理工学院Xiao-Hua Qin助理教授团队利用断层扫描体积生物打印（VBP）技术，将柔软的明胶甲基丙烯酰化（GelMA）生物树脂与三维内皮共培养相结合，致力于解决现有问题。研究人员对一系列不同GelMA和光引发剂浓度的生物树脂进行了表征，筛选出最佳配方，实现了在30秒内以高细胞活力打印复杂可灌注构建体。同时，研究了内皮共培养对人骨髓间充质干细胞（hMSCs）成骨分化的影响，并成功构建了可灌注的预血管化模型。相关工作以“Tomographic volumetric bioprinting of heterocellular bone-like tissues in seconds”为题发表在《Acta Biomaterialia》上。该研究为骨组织工程提供了新的策略，有望推动再生医学和体外药物筛选等领域的发展。

研究内容
1. 断层扫描体积生物打印构建体的优化研究
通过制备不同GelMA浓度和LAP浓度的生物树脂，进行激光剂量测试、原位光流变测量、机械性能测试以及细胞活性和形态分析等方法，研究适用于体积生物打印（VBP）且有利于骨组织工程的生物树脂配方。结果表明，5% GelMA和0.05% LAP的生物树脂为最佳配方，其兼具良好的打印性能、较低的刚度，能为细胞提供适宜环境，促进细胞铺展和hMSC的成骨分化，且细胞活力大于90%。

图1. 血管内皮共培养增强VBP和干细胞成骨分化

图2. VBP打印具有中空通道结构的体外模型

2. 光引发剂浓度对生物打印影响的探究
运用共聚焦显微镜观察染色后的打印构建体表面、原位光流变监测生物树脂交联过程、Zwick机械测试机测定凝胶压缩模量以及进行细胞活性和形态学分析等方法，研究不同LAP浓度结合相应光剂量对打印精度、凝胶物理性质和细胞活性的影响。结果显示，LAP浓度影响生物树脂的光交联效率和刚度，0.05% LAP的生物树脂综合性能最佳，在保证打印精度的同时，对细胞活性无显著不良影响，有利于细胞铺展。

图3. 用伊红Y染色和共聚焦荧光显微镜评价印刷结构体的表面光滑度

图4.LAP光引发剂浓度对凝胶交联、硬度和细胞活性的影响

3. 内皮共培养对hMSC成骨分化的作用研究
采用建立hMSC与HUVEC共培养体系，利用qPCR定量分析成骨和早期成骨细胞标记基因表达、进行ALP活性测定以及监测凝胶压缩模量变化等方法，研究内皮共培养对3D打印构建体中hMSC体外成骨分化和功能的影响。结果表明，共培养体系在成骨早期，多数成骨标记基因在单培养中表达较高，后期共培养中表达增强，尤其在21天后早期成骨细胞标记基因表达显著增加，且共培养的凝胶压缩模量随时间显著提高，意味着共培养促进了基质分泌。

图5. 3D共培养和单培养中骨分化的功能分析  

4. 预血管化构建体的体积生物打印研究
运用设计并打印含hMSC的带中空通道凝胶构建体，在通道中注入HUVEC细胞悬液，通过共聚焦显微镜成像观察等方法，研究利用VBP技术构建可灌注预血管化骨构建体的可行性。结果显示，成功构建了通道内有自组织内皮单层的预血管化模型，证明该方法可行，为后续研究流体诱导的剪切应力对细胞成熟和基质矿化的影响奠定了基础，但打印分辨率和内皮细胞接种方法仍需优化。

图6. 异细胞可灌注预血管化模型的建立

研究结论
本研究展示了通过断层扫描体积生物打印（VBP）技术，结合三维内皮共培养，能快速构建厘米级载细胞水凝胶构建体，促进体外成骨。通过系统筛选生物树脂成分，确定了5% GelMA和0.05% LAP的软生物树脂，其具有良好的打印性和细胞相容性。与10% GelMA的基准生物树脂相比，该树脂更柔软，有利于细胞 - 基质重塑和细胞间通讯。对hMSC/HUVEC三维共培养和hMSC单培养进行六周的功能分析，结果显示共培养体系在21天后，三维打印构建体中早期成骨细胞标记物（PDPN和DMP1）的表达增强，意味着共培养加速了成骨分化。此外，还成功构建了带有内皮细胞衬里的可灌注预血管化构建体。

挑战与展望
本研究虽取得一定成果，但仍面临挑战。目前构建体的基质矿化水平有限，且缺乏成熟的成骨细胞基因特征，需要进一步优化体外成骨分化策略。未来可通过实施光学调谐方法、引入其他促进成骨的参数（如与巨噬细胞/破骨细胞共培养、机械刺激）以及升级体外平台进行机械加载实验等方式，提高组织成熟度和功能。同时，优化VBP的分辨率和内皮细胞接种方法，有助于实现生理微血管化。该共培养VBP平台有望在再生医学和体外药物发现等领域，快速规模化制造更复杂的人体组织。

文章来源：
https://doi.org/10.1016/j.actbio.2022.06.020