《Biofabrication》：新型3D打印双层多孔水凝胶支架用于软骨--骨整合修复

来源： EngineeringForLife

软骨和骨的整体修复涉及到细胞的迁移和分化，这一直是一个难以解决的难题。暨南大学郭瑞副研究员和Zejian Li利用天然生物材料明胶构建了甲基丙烯酰基明胶（GelMA），一种具有高度细胞亲和力的水凝胶支架。将GelMA与不同成分混合，通过三维（3D）打印技术，在上、下层分别打印出不同模量和组成的双层多孔水凝胶支架。上层支架在GelMA中添加黑磷（BP）和人脐带间充质干细胞（hUMSCs）外泌体（exos），其具有相对较低的弹性模量，有利于骨髓间充质干细胞（BMSCs）向软骨分化。在下层支架中，除了BP和hUMSCs外，将具有骨传导和骨诱导作用的β-磷酸三钙（β-TCP）添加到GelMA中。β-TCP的加入显著提高水凝胶支架的弹性模量，有利于BMSCs的成骨分化。体外实验证实，双层支架分别能促进成骨和软骨分化。兔软骨-骨损伤模型中，MRI和显微CT结果显示，3D打印双层GelMA复合支架具有接近正常组织的修复效果。

相关研究内容以“Novel 3D-printing bilayer GelMA-based hydrogel containing BP,β-TCP and exosomes for cartilage–bone integrated repair”为题于2023年31日发表在《Biofabrication》。

图1 GelMA的化学成分及打印能力

1H NMR谱显示，在GelMA上出现甲基丙烯酸酯的特征官能团（图1A），证明成功合成GelMA。在GelMA/β-TCP冻干水凝胶支架的XRD模式中观察到β-TCP的特征峰（图1B）。BP的透射电镜图像显示横向尺寸约为200 nm的层状结构（图1C）。DLS结果表明，BP的平均水化粒径约为500nm（图1D）。随着温度的升高，不同比例的β-TCP复合油墨凝胶-溶胶温度基本相同，且低于GelMA，同时GelMA油墨在冷却过程中的凝胶-溶胶转变温度最大（图1E-H）。油墨通过喷嘴挤压，在5℃下与基板接触，形成一个弱凝胶状态的3D打印支架，然后为了保证支架的长期结构完整性，探索了油墨的光交联性能（图1I-L）。在365 nm紫外光照射10 s后，油墨处于凝胶状态，存储能量和损耗模量趋于稳定。因此在打印后紫外照射下获得具有较高结构完整性和力学性能的支架。

图2 GelMA复合水凝胶支架的物理性能及细胞粘附性

本研究使用挤压3D打印机成功地将上述几种生物墨水打印到3D网格支架中（图2A）。应力-应变曲线如图2B所示。通过添加1%和3%的β-TCP，GelMA/β-TCP的杨氏模量显著增加，且所有水凝胶材料在12 h左右达到溶胀平衡（图2C）。接着研究了该材料在含和不含溶菌酶的PBS溶液中的降解性能（图2D、E）。GelMA/β-TCP复合水凝胶在溶菌酶和无溶菌酶PBS溶液中的剩余重量均小于GelMA水凝胶。扫描电镜图像显示无论纵截面还是表面，都显示出有利于材料交换的多孔结构（图2F）。F-actin染色图像显示骨髓间充质干细胞的高面积覆盖指数和细胞连通性（图2G）。图2H显示了GelMA复合水凝胶支架上的骨髓间充质干细胞的活/死染色。BMSC均匀地存在于支架网格上，大部分细胞为绿色，染色后仅有相对较少的细胞为红色，说明BMSCs在支架上的存活率较高。因此GelMA/BExo和GelMA/β-TCP/BExo支架在骨和软骨生长过程中具有良好的生物相容性，对BMSCs无细胞毒性。

图3 体外成软骨分化

体外培养14 d、21 d后，不同组成的GelMA支架呈现出不同程度的蓝色（图3A）。定量分析GAG含量发现，GelMA/BExo支架上的GAGs含量显著高于GelMA/BP和GelMA/Exo支架（图3B、C）。Sox9是调控软骨分化的主要基因，COL 2a1基因编码Col II α1链，三个相同的α1链形成Col II，这是透明软骨的主要成分。Acan编码聚合。图3D-F显示与软骨生成分化相关的三个典型基因的表达含量。上述三个基因编码的蛋白表达水平与基因表达水平的变化趋势相似。图3G为三个基因编码的蛋白表达的WB图像，量化数据如图3H-J所示。以上结果表明，在软骨修复层中，BP和MSC外显子降解后产生的磷酸盐可能共同影响软骨细胞的增殖、代谢、基因表达和矿化前过程，从而实现软骨再生。

图4 体外成骨分化

将BMSCs与GelMA复合支架共培养14 d、21 d后，用茜素红染色法对成骨细胞的矿化结节进行染色（图4A）。共培养GelMA复合支架第14、21天茜素红染色的定量结果显示，GelMA/BExo//GelMA/β-TCP/BExo水凝胶支架成骨显著，其次是GelMA/BExo水凝胶支架（图4B、C）。BP可以增强OCN基因和蛋白的表达，GelMA/BP组的基因表达水平甚至与含β-TCP组更接近（图4D）。RUNX2基因在GelMA/BExo//GelMA/β-TCP/BExo水凝胶支架组中表达量最高，显著高于GelMA组（图4E）。在含有β-TCP的水凝胶中，col1a2的基因表达量较高，而在GelMA/BExo组中则保持在较低水平（图4F）。成骨相关蛋白的表达与基因表达趋势接近，WB定量结果如图4G-J所示。以上结果表明在GelMA水凝胶支架中加入β-TCP可显著增强成骨分化。

图5 兔体内软骨-骨再生

只有GelMA/BExo//GelMA/β- TCP/BExo组的再生软骨外观与周围组织几乎完全一致，肉眼几乎看不到损伤边界（图5A）。质子密度加权成像和3D脂肪抑制的梯度回波序列扫描的MRI结果显示，GelMA/Exo、GelMA/BExo和GelMA/BExo//GelMA/β-TCP/BExo组有连续的关节软骨，但GelMA/Exo组的软骨表面不如其他两组光滑（图5G）。T2作图结果显示，GelMA/BExo//GelMA/β-TCP/BExo组显著低于其他组（图5F），表明软骨损伤程度较低。micro-CT3D重建结果显示，损伤部位骨量较6周时明显增加，愈合趋势保持一致（图5B）。在GelMA/BExo//GelMA/β-TCP/BExo组中，除了冠状面和中矢状面有连续骨组织外，横断面也显示损伤部位完全充满骨组织，而其余五组仍有圆形或椭圆形腔（图5C）。在第14周时，GelMA/BExo//GelMA/β-TCP/BExo组的BMD达到0.3g cm−3，BV/TV达到32.5%（图5D、E）。

图6 治疗6、14周后软骨-骨缺损区域的组织学染色

图7 治疗6周后对损伤区域的组织学评估

图8 治疗14周后对损伤部位的组织学评估

图6为损伤部位第6周（图6A）和第14周（图6B）时组织切片的全扫描图像，用于评估组织修复和骨、软骨的分化。在第6周时，通过H&E染色可观察到关节软骨和松质骨的明显损伤。细胞从皮质骨迁移到关节软骨末端，逐渐填充损伤区域。在GelMA/BExo//GelMA/β-TCP/BExo组中，观察到关节软骨下的松质骨从损伤边缘到中心逐渐闭合。14周后，GelMA/BExo//GelMA/β-TCP/BExo和GelMA/BExo损伤区域完全闭合，松质骨小梁接近正常组织结构。Masson染色显示，在第6周时，GelMA/BP组的关节软骨和松质骨中有大量胶原沉积，而GelMA/BExo和GelMA/BExo//GelMA/β- TCP/BExo组的松质骨中胶原含量相对较低。

损伤区域进一步扩大后，治疗6周，对照组损伤部位几乎未见软骨细胞，而GelMA/BP组在损伤两端有大量的软骨细胞生长，接近正常组织（图7A），并一直迁移到损伤内部，直到材料中没有完全降解的部分（图7B）。GelMA/BExo和GelMA/BExo//GelMA/β- TCP/BExo水凝胶支架植入6周后，损伤部位主要由软骨细胞填充。

14周后，GelMA/BExo//GelMA/β- TCP/BExo组的骨环结构最清晰，厚度均匀，上软骨细胞与下成骨细胞边界清晰，厚度与正常组织基本相同，说明GelMA/BExo//GelMA/β- TCP/BExo组基本实现软骨-骨的整合修复。但在番红精O-fast绿色染色中，骨环上部的红色并不明显（图8A、B）。

综上所述，在用于软骨-骨整合修复的3D打印双层水凝胶支架的研究中，通过改变生物墨水的组成，设计了上下两层具有不同模量的GelMA水凝胶支架。体内和体外实验表明，双层GelMA/BExo//GelMA/β- TCP/BExo水凝胶支架具有促进软骨和骨分化的能力，软骨修复速度最快，再生质量最高。软骨下骨由软骨内成骨形成，关节软骨与松质骨之间的边界清晰，其厚度与正常组织基本相同。此外，3D打印技术可以用于定制缺损的形状，这对于治疗严重的软骨损伤、骨性关节炎和其他损伤软骨下骨的软骨疾病是非常有潜力的。

文章来源：

https://doi.org/10.1088/1758-5090/ad04fe