该文章的作者是南极熊网友：中国生物3d打印机开发者刘博士。刘博士将从组织工程、生物制造、几种关键技术、生物3D打印输送系统等部分介绍。由于文章内容很充实，南极熊将以连载的形式给大家介绍。
生物3D打印关键技术
生物三维打印的目标就是根据生物学和组织工程产品的要求，采用计算机建模技术设计三维模型，将生物材料（支架材料）、细胞和生长因子等，使用某种使能方法，将材料离散为零维的点单元或一维线单元，然后按照模型信息，将这些离散的材料单元层层堆积装配成为所设计的结构。材料和CAD模型信息是输入，针对所使用的材料及其性能，设计生物打印过程，根据打印过程需求，设计生物打印装备，最终将产品打印出来（如支架、三维细胞结构体甚至人工组织器官）。所谓生物打印过程设计包括材料的预制备过程、材料打印过程和打印后处理过程，材料预制备过程是指生物材料需配置成溶液、粉末或丝材等作为打印原料的过程；材料打印过程是指用何种成形转变机制将离散的材料单元装配成为完整的三维结构，常见的方法包括加热熔融后凝固成形、低温凝固成形、交联固化成形、光固化成形、粉末烧结成形和粘接剂粘接成形等，选择合适的成形转变机制是打印过程设计的关键一环；后处理过程是指对打印后的结构进行后续的处理工艺设计，如低温沉积工艺制造的支架需要通过冷冻干燥工艺去除有机溶剂，细胞三维受控组装工艺制造的细胞三维结构需要通过离子交联或共价交联进行结构的固定以及合成聚合物支架为改善细胞黏附性能从而进行材料表面改性等。
因此，生物三维打印系统的设计不仅仅是装备的设计，而是首先根据目标产品的要求，进行材料体系设计，选择被打印的生物材料，根据材料的性能，设计可行的打印工艺，然后根据打印过程的要求再进行装备的设计。考虑到生物材料种类繁多，材料性能不一，设计一台可适用于所有生物材料加工的三维打印装备是非常困难的。
生物三维打印的研发过程及其关键技术
生物三维打印技术的研发过程如图2.1所示，所有组织工程技术研发的起点应该是选定目标修复组织，然后分析组织器官的结构特点，有些组织为二维层片状，如皮肤、角膜、软骨等；有些则为管状类，如血管等；有些为三维块状，如骨组织以及肝脏、肾脏、心脏等复杂器官。根据被修复组织器官的结构特点，确定其是否适合于用生物三维打印技术来构建，该技术更加适合于具有三维块状结构特征的组织，而二维层片状组织如皮肤、角膜和软骨等可能更加适合其它类技术。若选定生物三维打印技术后，则需考虑是基于支架技术路线还是无支架技术路线。一般来讲，无支架技术路线目前受限于可以加工的材料种类，往往使用力学性能较差的天然生物材料和细胞，因此适用于软组织的构建；而支架则可以用合成聚合物材料制造，力学性能可以根据组织特点在很宽的范围内调节，不但适合软组织也适合硬组织的构建。 图2.1 生物三维打印技术研发过程 对于基于支架的生物三维打印技术，选择合适的细胞种类及来源，进行体外扩增。然后设计三维支架，支架的设计包括支架材料设计和支架结构设计，根据所选用的生物材料及其性能，设计其使能方法，如熔融挤压、低温凝固、熔融粘接、粉末烧结或辐射固化等，根据所选择的使能方法，开发生物三维打印设备，制造所设计的支架，然后种植细胞，进行体外培养，最终获得人工组织或器官。
对于无支架生物三维打印，首先进行组织器官模型设计，包括细胞类型选择及其来源，基质材料设计和模型结构设计；然后选择装配单元类型，一般可以采用连续线单元或离散点单元，不同的单元类型，则装配使能方式的设计也不同；然后开发打印设备，进行组织器官模型打印，经体外培养后获得人工组织器官。在上述研发过程中，除细胞及其来源是生物学需解决的基础问题外，涉及的关键技术包括： （1） 材料体系设计——材料体系设计是生物三维打印的关键一环，单一类型的生物材料可能无法满足组织修复的需求，材料设计应该从仿生的角度综合考虑生物相容性、机械性能和材料降解性能等选择合适的生物材料体系及组成，此外，材料体系的设计决定了材料使能方式。 （2） 支架和组织器官模型的建模技术——支架和组织器官模型的结构设计包涵了宏观外形、微观结构和材料分布，理想的情况是能够模拟人体天然组织的特征，构建非均质模型。 （3） 材料使能技术——材料体系设计之后，选择合适的使能方式将材料离散成为点单元或线单元来层层构建三维结构，且实现材料单元之间的连接是实现结构成形的关键一环，这些均取决于材料本身的性能。 （4） 生物三维打印设备开发——生物三维打印设备一般包括运动系统、控制系统、软件界面、材料输送系统和成形环境设计等方面，是典型的机电一体化设备，属于先进制造技术与生命科学的交叉前沿。 （5） 体外培养技术及后处理——打印后的细胞-支架复合体或组织器官模型必须经过体外培养才能重建其生理功能，其中生物反应器的设计是关键，生物反应器为构建的人工组织提供外源性的各种刺激来模拟人体生理环境，重要的因素包括O2和CO2浓度、细胞因子、温度、力学信号、PH值以及灌流速率等。
为使基于生物三维打印的人体修复技术走向临床应用，必须解决上述关键技术中的每一个问题，并制定相应的设计标准，而目前仍处于研究阶段，本论文关注的则是与制造相关的问题包括建模技术、材料使能技术和设备开发相关的问题，尤其关注解决材料使能技术和设备开发两方面。 生物三维打印材料及使能技术
生物材料可以分为三类，即支架材料、细胞以及生物活性分子，其中支架材料为细胞提供黏附表面，并作为细胞迁移、增殖和分化的外部环境，提供机械支撑。细胞作为生命的基本单元，可以看做一种特殊的材料，细胞与支架材料之间的相互作用对支架植入体内后的变化起着关键作用，细胞可在支架制造完成后再进行体外种植，在这种情况下细胞不直接参与打印过程，此时的生物三维打印过程就仅仅是支架材料的三维打印。细胞也可直接作为被打印材料，参与制造过程，此时的生物三维打印就是细胞三维打印，细胞必须与某种具备成形转变机制的外基质材料同时打印以辅助结构的成形（往往选用水凝胶材料）。生物活性分子包括一大类对细胞的生理功能起调节作用的分子，如生长因子、类固醇、激素、多肽甚至DNA和RNA，目前将这些分子作为单独的打印材料参与制造过程仍然面临很大的困难，因为这些分子在支架内很难固定，体外培养时很容易扩散到培养介质中，导致效果不佳，目前采用的解决方法为支架制造后进行材料表面改性或在将支架本身作为生长因子缓释的载体以提高细胞的功能表达和组织形成能力。
生物材料使能技术是实现生物三维打印的关键一环，如何将生物材料离散然后堆积成为三维结构是材料使能技术需要解决的问题。为了便于应用，表2.1列出了常见的生物材料使能方法、原材料形式、适用材料和优缺点。
从表2.1中可以看出，应用于生物三维打印的材料使能技术多种多样，材料体系的设计则是选择材料使能方式的基础，而材料体系的设计则取决于被修复组织器官的需求。 表2.1常用生物材料及其使能方式
| | | | | | | FDM熔融粘接 | 丝材 | 热塑性聚合物如PCL、PLA、PGA、PLGA；PLGA-TCP/HA复合材料 | 装置简单、可直接购置商用三维打印机 | 材料结构被破坏，尤其是分子量发生改变、原材料制备复杂、复杂结构需要支撑 | | | 激光下可熔融但不分解的粉末材料，如PCL、PCL/TCP、HA、PVA、PLA等 | | | | | | | 需要专门的可光固化材料体系、残留的未聚合单体和光引发剂有毒性 | | | | | | | | 可溶于某种溶剂、在低温下结晶的聚合物，如PLA、PGA、PLGA、PCL、明胶、海藻酸钠、胶原等 | 材料适用范围广，可制造多级孔隙支架，加入TCP或HA粉末制造复合材料支架 | 需有机溶剂，残留的有机溶剂有毒性，设备复杂，复杂结构需支撑 | | | | 在温度变化下发生溶胶凝胶转变的材料，如明胶、透明质酸、卡拉胶等 | 无需交联剂、可通过喷射过程温度的变化来成形、过程无细胞毒性 | | | | 在离子作用下发生离子交联的聚合物，如海藻酸钠在二价阳离子作用下、壳聚糖在多聚磷酸钠作用下 | | | | | 在某些物质作用下发生共价交联的聚合物，如纤维蛋白在凝血酶作用下，明胶、海藻酸钠、壳聚糖、胶原、纤维蛋白等在戊二醛等作用下 | | | | | 在光照射作用下发生共价交联材料，如胶原在紫外光作用下 | | |
生命体计算机仿生建模技术用于组织修复的支架或细胞结构体的计算机建模技术是生物三维打印的重要组成部分，只有建立了计算机数字模型的基础上，才能够将数字模型打印成为实体结构。在传统的三维打印中，被打印对象往往为均质结构，即材料和结构在整个打印对象内是均匀分布的。而人体器官的组成结构则体现出极其复杂的非均质特性，人体天然组织往往可以划分为多个区域，如人体骨关节可以分为软骨区域、钙化层、软骨下骨区域（松质骨）等组成，图2.2为股骨的区域划分，这些区域的细胞类型、材料组成、力学性能和外形轮廓差异非常大。
图2.2 股骨区域划分示意
仿生设计则是根据天然组织不同区域的性能要求，合理地选择材料、设计结构和外形，并用计算机数字模型表达。仿生建模的第一步是对象的分解，整体结构为各个子区域的并集。 而每个子区域Oi(i=1…n)的属性包括材料、结构和外形三个要素，即
其中材料的确定依赖于子区域的细胞黏附和生长要求、力学性能要求、生物相容性和生物降解性能等，因此：
结构（architecture）则包括微观结构和宏观结构，包括孔隙的形状、大小、相互贯通性和孔隙率等特性，结构的确定取决于细胞和组织长入需求，氧、营养物质和代谢产物等扩散需求，力学性能需求等，因此：
外形既包括整个结构的宏观外形，又包括各个子区域间的空间轮廓边界。从仿生的角度考虑，两部分外形均应按照人体天然组织来设计。目前，医学影像技术的发展尤其是计算机断层扫描技术（computedtomography，CT）和核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）为确定人体结构的宏观外形和组织边界奠定了基础。通过CT和MRI二维图像结合mimics等模型重构软件可以逆向地获得人体组织器官的三维模型。这为确定结构的宏观外形和各个子区域的空间轮廓边界提供了有利条件。
在划分子区域的基础上，可以有两种方法制造出包含多个子区域的整体结构：即子区域分体制造+装配的方式和整体制造。分体制造然后装配的思路类似于机械设计中的零件与装配体之间的关系，这种方式可以大大减小制造难度，然而子区域间的连接方法、连接的可靠性和区域边界的吻合程度等问题使得分体制造然后装配的路线面临很大的困难。可能考虑的方式是研发某种生物相容性好的粘接剂可以将生物结构粘接在一起，目前尚未检索到采用这种思路的相关研究。
对于整体制造，若采用生物三维打印技术，则需要多个喷头按照各个子区域的要求打印相应的材料，然后堆积成为整体的三维结构。 进一步分析，对材料而言，子区域内的材料materials(oi)又可能存在如下如下两种情况：
均质材料——即子区域内各处材料成分及组成是一致的，无论其复合多少种材料，都可看做一种材料，这样就大大简化了问题的复杂度，仅需一个喷头就可以制造出一个子区域； 非均质材料——即子区域内部各处的材料及组成是变化的，在这种情况下问题的复杂度会大大增加，仅单个子区域的制造就需要多个喷头才能实现。 事实上，当把组织器官按照结构和功能划分为多个子区域后，组织器官子区域内的细胞种类和外基质构成基本是相同的，因此，无需在子区域内采用非均质材料来构建。在这种情况下，对生物三维打印而言，所需的喷头数量即等于所划分的子区域数目。
可能存在的一种情况是在子区域间的界面上可能需要梯度材料结构，这种具有材料成分渐变特征的梯度结构的模型如图2.3所示。构建这类复杂的组织界面仍然是目前组织工程中面临的巨大挑战。 图2.3 组织过渡界面上的材料组分渐变梯度结构
目前现有的非均质实体建模方法包括：全局函数合成、局部函数合成、材料区域指定、基于元胞单元体（unit cells）布尔运算建模以及由清华大学郑卫国提出的基于区域/模板填充建模技术。迄今为止，非均质建模技术尚未包含到商业CAD软件系统中，导致非均质建模技术在应用时面临很大的困难。此外，此类材料组分渐变的梯度界面对于构建用于组织修复的支架或细胞三维结构体的必要性和意义也有必要进一步探讨。
对于结构而言，前面已提及，其对细胞向支架内部迁移、新生组织的生长、营养物质交换和代谢产物排出以及支架的力学性能具有重要的影响。对于生物三维打印而言，宏观孔隙是由材料路径交叉交叉形成的，通过控制材料路径的间距和交叉取向可以获得不同的孔隙形状、大小以及相互贯通性，如图2.4所示。
图2.4 由材料路径形成的不同形状和大小的孔隙结构 划分后的子区域需要根据生物学和力学性能要求选择最优的孔隙结构，然而建立这些不同孔隙的结构与生物学性能和力学性能之间的联系并针对特定的应用进行结构优化方面的工作仍然非常欠缺。 根据支架的复杂度等级、材料和结构的梯度特征，论文将支架划分为如下五类，如表2.2所示，根据分析，构建多区域梯度支架具有重要的研究价值，在此基础上根据组织器官构建的需求，可以考虑包含材料组分梯度变化的子区域界面，而子区域内的材料梯度和结构梯度意义不大。 表2.2 不同复杂度等级的支架
| | | | | | | | | | | | | | | | 1.子区域材料为均质 2.各子区域材料不同 3.子区域界面材料组分梯度变化 | 1.子区域无梯度结构 2.各子区域结构不同 3.子区域界面无结构梯度 | | | IV级 多区域梯度支架 材料组分梯度界面 子区域结构梯度 | 1.子区域材料为均质 2.各子区域材料不同 3.子区域界面材料梯度变化 | 1.子区域为梯度结构 2.各子区域结构不同 3.子区域界面无结构梯度 | | | V级 多区域梯度支架 材料组分梯度界面 子区域结构梯度 子区域材料梯度 | 1.子区域材料为非均质 2.各子区域材料不同 3.子区域界面界面材料梯度变化 | 1.子区域为梯度结构 2.各子区域结构不同 3.子区域界面无结构梯度 | | |
因此，目前重点研究的应为表中II级复杂度即多区域梯度支架的建模技术以及相应的制造方法。
以上谈到的主要为生物材料支架，对于无支架技术路线，方法是类似的，区别在于不同区域内的材料是指不同的细胞类型。
生物三维打印设备开发生物三维打印设备是将计算机虚拟数字模型转变为实物的核心技术装备，也是生物三维打印技术研发的关键环节。这类设备包含一般三维的共性技术包括： （1）三轴运动系统（three-axismotion system）——XYZ三轴运动系统是所有三维打印设备的必备部分，一般由XY轴进行平面扫描运动，Z轴带动升降平台实现材料的层层堆积制造。一般各轴的运动均是通过电机驱动的，根据电机类型，可以分为：步进电机运动系统、伺服电机运动系统和直线电机运动系统。运动系统的选择直接关系到设备的定位精度和设备成本，其选择应该在满足使用要求的基础上尽量降低成本。 （2）数控系统（motion controlsystem）——数控系统是驱动所有电机运动的核心控制部分，对生物三维打印设备而言，需要按照数控代码实现多个运动轴的协调运动，因此需要高性能的多轴运动控制器作为核心来搭建数控系统，数控系统的性能对生物三维打印设备的最终性能也有重要的影响。 （3）材料输送系统（materialsdelivery sytem）——材料输送系统是生物三维打印系统的核心部分，其设计需根据所选用的生物材料性能，选择相应的使能方式，然后根据使能方式确定输送系统的设计。 （4）成形环境设计（formingenvironment design）——对于任意一种生物三维打印装置，可能都需要工作在某种特定的温度、湿度甚至清洁度等条件下，相应的成形环境的设计也是设备开发的重要方面。 （5）成形控制软件界面（Graphic-User-Interfacesoftware）——控制软件的功能是将计算机建立的数字模型进行信息的加工处理，转换成为驱动电机运动的数控代码，并监控制造过程。
在以上子系统中，材料输送系统是硬件系统中最为核心的部分，也是生物三维打印区别于普通三维打印的根本所在。本论文将以细胞-水凝胶材料连续线单元作为装配单元来设计细胞三维打印设备。
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