3D打印可自固化仿生松质骨陶瓷基支架协同金属-多酚纳米颗粒治疗感染性骨缺损

来源： EngineeringForLife

感染性骨缺损是一类由微生物感染引起的骨损伤或缺损，常由严重污染的骨折或血源性感染引起，目前临床上对感染性骨缺损的治疗主要通过感染控制和骨缺损重建，其中使用抗生素骨水泥抑制细菌以及骨移植修复技术是最常用的治疗方法，但存在细菌耐药性增加、需要二次取出骨水泥等问题。因此通过组织工程技术制备兼具抗感染与促成骨效应的生物支架是解决此类疾病的研究热点。

近日，受临床骨水泥固化性能启发，来自四川大学钱志勇教授团队和刘显教授团队利用α-磷酸三钙（α-TCP），β-磷酸三钙（β-TCP），明胶（Gelatin）和聚乙烯醇（PVA）构建生物墨水，并采用低温3D打印技术制备具有可自固化功能的仿松质骨结构和成分的人工骨支架并负载具有金属-多酚网络结构的茶多酚-镁（TP-Mg）纳米颗粒实现骨诱导能力、抗菌特性和抗炎特性协同解决感染性骨缺损难题。本文第一作者为成都大学胡旭麟博士以及四川大学华西口腔医院陈娇博士，感谢重庆医科大学杨舒皓硕士，成都大学邬浩明硕士，河南科技大学贺剑博士等人为论文的帮助，特别感谢EngineeringForLife（EFL）团队的帮助，使用打印机型号：EFL-BP-6601。相关研究以题为“3D Printed Multifunctional Biomimetic Bone Scaffold Combined with TP-Mg Nanoparticles for the Infectious Bone Defects Repair”发表于《Small》。

图1 研究流程示意图

本研究提出了一种利用将具有自固化性能的α-磷酸三钙(α-TCP)与β-磷酸三钙(β-TCP)复合，通过低温3D打印构建仿生松质骨支架体系(α/β-TCP)，并将明胶作为有机相保存在支架内部，随后负载金属-多酚网状结构的TP-Mg纳米颗粒，在调控感染性骨缺损早期微环境的同时，促进晚期骨再生愈合，在感染性骨缺损的治疗中具有良好的应用前景（图1）。  

图2 金属-多酚纳米颗粒以及生物墨水表征

首先作者通过透射电子显微镜图像（图2A），zeta电位测试（图2B）以及傅里叶变换红外光谱（图2C）验证了TP-Mg纳米粒子的制备。为了验证α-TCP的固化性能，作者通过使生物墨水倒置在瓶中观察期流动性能。为了探究适宜的打印条件以及生物墨水配比，作者讨论了不同打印温度以及不同α-TCP含量的墨水挤出性能，最终发现在打印温度（15℃-30℃）窗口下能够较好的挤出0%-30%α-TCP含量的生物墨水，并通过流变学进一步验证墨水的打打印性。   

图3 复合支架的宏观微观形貌以及基本性能表征

图3A显示了3D打印复合陶瓷支架的宏观照片，在扫描电子显微镜下（图3B）观察到贯穿大孔结构同时，在更微观角度下发现α-TCP水合在β-TCP无机盐颗粒表面以及相互连接的明胶网络结构，实现了对松质骨宏观微观结构以及成分的多级仿生。进一步低，通过XRD验证了α-TCP向CDHA的相变（图3C），随后作者对支架的孔隙率，吸水率，表面粗糙度和亲水性能进行表征（图3E-H）。   

图4 复合支架的力学性能，矿化行为和降解行为

高温烧结的陶瓷支架往往具有脆断性，而低温3D打印技术由于支架内部有机相的保留避免了在高强度压缩下的脆断行为（图4A），同时作者发现，α/β-TCP支架的力学强度与α-TCP的比例呈正相关（图4B），并且支架的力学强度随着水合时间（1、3和6 h）逐渐增强，最终超过100MPa（图4D）。药物释放实验也表现出药物良好的释放行为（图4E）。此外，作者对支架的矿化行为以及降解行为进行了验证（图4F-H）。   

图5 复合支架的生物相容性评价

通过细胞活死染色，CCK-8分析和扫描电镜下细胞黏附行为观察出复合支架的良好生物相容性（图5A-D），但也观察到30α/β-TCP@50TP-Mg支架对细胞增殖有一定的抑制作用。

图6 复合支架的体外成骨效应

体外ALP和茜素红实验观察到30α/β-TCP@10TP-Mg 组表现出最显著的染色结果（图6A-C）。通过对不同时间段的成骨基因表达进行检测也发现30α/β-TCP@10TP-Mg 组支架具有稳定的促成骨效应（图6D）。这可能是因为TCP无机盐支架的Ca2+与TP-Mg纳米粒子中的Mg2+的协同作用。   

图7 复合支架的体外调控巨噬细胞极化性能

感染性骨缺损往往伴随着较强的炎性环境，作者通过用脂多糖（LPS）刺激巨噬细胞向M1极化后，通过与复合支架共培养后发现，支架释放的TP-Mg有效的降低了M1标志物CD86和INOS的表达以及促进M2标志物CD206表达（图7C-D）。通过PCR与Western blot蛋白分析同样观察到用30α/β-TCP@10TP-Mg组处理后INOS表达的下调和精氨酸酶-1（ARG-1）表达的上调（图7E-F）。  

图8 复合支架的体外抗菌性能

为了解决对感染性骨缺损中细菌的有效杀灭，作者通过细菌活/死图像以及扫描电镜下支架细菌共培养验证了TP-Mg对金黄色葡萄球菌的有效抑制（图8A-B）随后通过测量培养后的OD600和ROS水平来检查细菌增殖（图8D，E），结果表明，与30α/β-TCP@10TP-Mg和30α/β-TCP@50TP-Mg共培养后，金黄色葡萄球菌的生长受到限制，ROS产量显著增加。   

总之，作者从临床角度阐述感染性骨缺损的特点和当前存在的问题。我们利用低温3D打印技术制备了一种能够为骨缺损提供足够机械强度和骨传导性能的仿生骨陶瓷支架。此外，我们通过负载TP和Mg自组装纳米颗粒构建了具有抗炎、抗菌和骨诱导性能的α/β-TCP@TP-Mg复合陶瓷支架。研究结果表明，α/β-TCP@TP-Mg复合支架具有良好的生物相容性、优良的成骨能力以及抗炎、抗菌活性。在大鼠感染性骨缺损模型中也显示出有前景的修复作用。该新型医疗产品有可能实现感染性骨缺损的精准治疗，而无需二次手术或过度使用抗生素，从而为感染性骨缺损治疗的探索提供更丰富的研究内容。

文章来源：
https://doi.org/10.1002/smll.202403681