《Advanced Science》：生物3D打印功能化气管重建

来源： EngineeringForLife
本论文第一作者：霍莹莹、徐勇、吴晓娣；
通讯作者：华宇杰、Y. Shrike Zhang、周广东。该工作材料学部分得到了上海交大朱麟勇教授团队的大力支持。  


功能化气管重建一直是临床上面临的重大挑战，其关键技术难点在于缺乏理想的气管移植物。组织工程技术为构建功能化气管移植物提供了一种可行的策略。目前，利用组织工程管状软骨实现的气管再生已初步得到验证，但是管状气管软骨结构不可避免会造成运动过程中的局部机械应力集中，同时也缺乏构建分布在软骨结构之间的血管化纤维结缔组织和管腔内壁上皮组织。众所周知，天然气管是具有交替分布的软骨环（C环）和血管化纤维环（VF环），以及气道内壁上皮化构成的管状异质组织结构，这种异质组织结构对于实现气管的力学和生理功能重建至关重要。

近期，上海交通大学医学院附属第九人民医院、上海市组织工程重点实验室、组织工程国家工程研究中心周广东团队，联合哈佛医学院Y. Shrike Zhang教授，设计并开发了一种组织特异性光交联生物墨水，并应用生物3D打印技术构建软骨-血管化纤维组织交替结构的仿生气管（CVFIT）。如图1所示，C环和VF环交替设计的管状结构可以精准模拟天然气管的生理结构与功能。其中，C环是由软骨细胞负载的软骨特异性光交联生物墨水（p-CB）构成；VF环是由成纤维细胞负载的纤维组织特异性光交联生物墨水（p-VFB）构成；并通过酰胺化反应实现C环与VF环之间的一体化化学键键合。生物3D打印的CVFIT不仅能够在体内实现软骨-血管化纤维组织一体化的气管再生，而且能够实现节段性气管缺损修复。相关研究论文：“Functional Trachea Reconstruction Using 3D-Bioprinted Native-like Tissue Architecture Based on Designable Tissue-specific Bioinks”发表于Advanced Science上。

图1 组织特异性生物墨水构建及功能化气管重建示意图

1. 组织特异性生物墨水制备与表征
为了构建适合软骨和纤维组织再生的生物墨水，研究者选择软骨组织来源的脱细胞细基质制备光交联软骨脱细胞基质（ACMMA）水凝胶，并添加甲基丙烯酰化明胶（GelMA）和甲基丙烯酰化硫酸软骨素（CSMA）构成软骨特异性光交联生物墨水；选择真皮组织来源的脱细胞细基质制备光交联真皮脱细胞基质（ADMMA）水凝胶，并添加甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）和八臂琥珀酸酯化聚乙二醇（8-PEG-NHS）构成血管化纤维组织特异性光交联生物墨水。两种组织特异性光交联生物墨水均可通过光引发自由基聚合反应实现快速交联和有效增强力学强度，而8-PEG-NHS介导的两相界面酰胺化反应能够显著加强相邻环之间的界面整合。荧光染色和原子力显微镜（AFM）图像证实了界面的无缝融合；X射线光电子能谱（XPS）证实了基于酰胺化反应的界面化学键整合。进一步，力学有限元分析结果显示，软-硬交替管状结构具有纵向拉伸性和侧向弯曲能力，而单一硬度管状结构在侧向弯曲时会导致局部区域机械应力集中，同时也缺乏纵向拉伸性（如图2所示）。

图2 组织特异性生物墨水及界面整合表征

2. 仿生气管打印构建与表征
首先，研究者证实温敏性p-CB生物墨水和高粘度p-VFB生物墨水是两种挤出式生物3D打印的可行策略。接着，研究者利用p-CB和p-VFB生物墨水，通过双喷头生物3D打印技术，构建出具有交替管状结构的气管类似物，然后在紫外（365 nm, 20 mW/cm²）光照下进行交联成型，以增强力学强度并维持三维形态。在多细胞生物3D打印中，荧光标记的软骨细胞（绿色）和成纤维细胞（红色）呈现交替分布于管状结构中，从而证实结合组织特异性生物墨水的生物3D打印技术能够实现多种细胞的精准定位和异质结构构建。（如图3所示）

图3 生物墨水可打印性评价和生物3D打印仿生气管表征

3. 体内气管再生与功能评价
研究者将生物3D打印CVFIT植入裸鼠皮下，并系统进行了大体观、力学性能、组织学染色、定量检测评价。实验结果表明，皮下植入8周后，实验组CVFIT成功再生了软骨-血管化纤维组织交替结构的仿生气管，而对照组仅为单一软骨管状结构。由于软-硬交替分布的组织结构，再生的仿生气管表现出优异的抗压性、纵向拉伸性和侧向弯曲能力；而再生的软骨管，由于再生软骨仅仅呈现单一硬度结构，使得缺乏纵向拉伸性，在侧向应力加载下存在明显的结构缺陷，这不可避免会对运动（如抬头、低头、颈部侧向弯曲等）过程中气管通气顺畅产生不利影响。组织学结果进一步证实，再生的仿生气管呈现与天然气管类似的软骨-血管化纤维组织交替结构以及组织特异性ECM沉积，这一仿生结构设计保证了软骨环可以从邻近的血管化纤维环中获取足够的营养供应。总之，软-硬交替组织结构的再生气管不仅有利于力学功能重建（抗压、拉伸和弯曲能力），而且有利于气管生理学功能重建。（如图4所示）

图4 体内气管再生与功能重建评价

4. 节段性气管缺损修复评价
为了进一步验证仿生气管实现原位功能重建的可行性，研究者首先将生物3D打印的CVFIT经体内皮下植入预培养8周，然后将再生气管连同血管蒂进行端到端吻合术，修复兔节段性气管缺损（15 mm长）。术后8周，再生气管呈现完整连续的管腔结构，内表面光滑，无痰液堆积，并且与天然气管实现一体化整合。组织学结果表明，生物3D打印的仿生气管可以实现与天然气管类似的软骨-血管化纤维交替结构的组织再生和上皮化功能重建。（如图5所示）

图5 节段性气管缺损重建修复评价

文章来源：
http://doi.org/10.1002/advs.202202181