南京财经王立峰、蒋栋磊:DLP打印仿生小肠绒毛细胞传感器用于食品过敏原检测

3D打印生物医疗
2022
01/06
11:18
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来源: EngineeringForLife

在细胞传感器中,主要依赖于二维的细胞固定化方案,但是二维的细胞培养环境只是简单的细胞堆积形成空间上的错位,与人体微环境有很大区别,而且体外组织模型存在着代价高,周期长,重复率低等缺点。之前研究均单纯以肥大细胞2D状态或与凝胶混合后的3D状态固定于传感界面(电极)的表面,细胞只是单纯的聚集在一起没有形成模拟组织的立体结构,无法全面真实的模拟体内过敏原反应机理,且缺乏原生器官的建筑特征,从而无法产生更高层次的功能特征,而真实体内过敏反应发生时肥大细胞是游离附着于组织和器官表面发生脱颗粒效应的。过敏原蛋白被摄食消化后首先进入肠道进行吸收,因此小肠是过敏反应发生第一效应器官。但由于现有的技术仍然存在挑战,生物打印无法真正的模拟组织或器官的天然生理功能,本研究尝试用3D打印宏观尺度上打印小肠微绒毛结构,通过调控组织尺寸和结构,在其负载肥大细胞,模拟体内真实过敏环境,又进一步实现3D立体式检测,尝试实现单一成分细胞检测到组织工程检测的跨步,使三维组织检测成为可能,实现更真实更全面的生物传感模拟。

相关研究以题为:A biomimetic ‘‘intestinal microvillus” cell sensor based on 3D bioprinting for the detection of wheat allergen gliadin发表于Bioelectrochemistry杂志,南京财经大学的王立峰教授为通讯作者,蒋栋磊副教授为第一作者。

目前,在3D打印中常用的是挤出式的打印方法,挤出式打印是较成熟的生物3D打印方式,普遍采用的是温敏成型工艺,通过喷头挤出丝状材料逐层打印为三维实体,适用性广,可对大多数打印墨水良好匹配,形成范围广阔的材料应用领域,但是对一些微小器件挤出式打印无法形成精确打印且打印过程中往往会造成出料不可控,喷头堵塞,材料浪费。投影式光固化生物3D打印利用光的波长和热作用可使光敏生物墨水发生聚合反应,对墨水进行有选择地固化,就可以在不接触的情况下打印所需的三维实体原形,与其他3D打印技术的工艺相比,光固化原位点打印技术的突出优点就是精度高,成型快、原材料利用率高(接近100%),构建相对形状复杂、特征精细的打印体,因其高精度的打印特点,可实现最小打印精度为25微米(μm)的打印结构,已在体外组织构建、组织修复、药物筛选、人工假体等相关领域有所应用,所以本次生物打印选用EFL-BP-8600投影式光固化生物3D设备精确打印出团簇状的小肠微绒毛结构。

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图1 小肠绒毛模型的建模与实物

在打印墨水的选择上,选用以甲基丙烯酰化明胶(GelMA水凝胶,EFL-GM-90)为主打印墨水,因其GelMA为双键改性明胶,其溶液可通过光固化成胶,GelMA分子中含有RGD细胞黏附序列,其形成的三维网络结构具有优异的生物相容性,可以制造载细胞的具有微-纳米多孔的水凝胶支架,但对于单纯的 GelMA 不具有导电性,无法更好地模拟生物组织内微弱的导电环境,细胞之间无法进行电信号交流。因此,需要导电以提高检测灵敏度且并不影响细胞活性的新材料。目前有几种方法可以提高电导率,例如添加导电材料,包括金属纳米粒子、氧化石墨烯、碳纳米管、导电聚合物等。在电化学传感器制备中,氧化石墨烯为主的碳纳米材料是最常用的导电材料,但其因为分散性较差和较大的颗粒尺寸无法在微米级别的光固化打印中使用,而聚苯胺(PANi)和聚吡咯(PPy)具有良好的应用前景,但它们的主要缺点是不溶于水。因此,迫切需要能够分散于水中并与细胞相容的导电材料。碳纳米管由于其良好的生物相容性和优异的电化学特性而被许多研究者关注。然而,对于多壁碳纳米管而言,缺乏稳定性和均匀性,很容易造成沉积是必须考虑的问题。因此,如何制备一种导电且水溶性的打印墨水是目前亟需解决的问题。我们使用酰肼化改性的多壁碳纳米管,可以稳定分散在水中,与凝胶一起使用。这些带正电的纳米管理论上可以与带负电的细胞膜相互作用,通过改善细胞粘附来增强其功能。但是单一材料的使用并不具备显著的信号放大。复合的纳米材料在传感器的制备中占有重要角色,普遍的是与金属进行复合,但金系和银系为主要代表的纳米材料的昂贵成本等不足之处限制了其应用,铜纳米材料则恰恰相反,价格低廉且容易合成,具有良好的抗菌性,高的电催化能力等最近受到许多研究者关注,尤其以铜纳米材料基元来筑造更高级的三维纳米体系。
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图2 铜纳米花的电镜

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图3 复合导电水凝胶

细胞固定在绒毛状结构上如图4,激光共聚焦结果表明,在短时间内细胞可以固定在结构表面,该小肠绒毛状结构可以为RBL-2H3细胞提供良好的三维物理条件。对电化学过程形成了屏障,阻止氧化还原探针进入电极表面,从而导致电子转移电阻增加。

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图4 细胞在微绒毛组织上固定

随后,对构建的细胞传感器进行电化学表征以及细胞固定化条件的优化,当小肠微绒毛结构放置在工作电极上(曲线d)时,电化学过程形成了一个屏障,阻止了氧化还原探针进入电极的表面。在添加MWCNT-CDH/FCONp(曲线b)后,工作电流明显增加,说明复合纳米材料具有良好的导电性和较高的催化活性;当RBL细胞被固定时,峰值电流明显降低(曲线c),这可能是由于细胞粘附和电阻增加,阻碍了电子转移。对于细胞固定化的条件,实验结果表明,3D生物打印细胞传感器优化后的细胞数量和固定化时间为1×106 cell/mL和10分钟。
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图5 电化学表征及优化

电化学细胞传感器在食品过敏原蛋白的检测中具有较好的应用前景,电化学阻抗谱法(EIS)是测定不同浓度小麦醇溶蛋白的有效方法。如图4A所示,随着麦醇溶蛋白浓度从0.1 ng/mL增加到0.8 ng/mL,Nyquist图上的半圆直径增大,在麦醇溶蛋白浓度为1.0 ng/mL时达到最大值,表明细胞逐渐被激活。同时,生物活性介质被释放,这阻止了电子在电池和电极之间的转移,因此阻抗值不断上升。随着浓度的不断增加,阻抗呈现下降趋势,这表明醇溶蛋白浓度的增加会逐渐导致一些细胞的凋亡或死亡,使得大量的细胞从凝胶的表面脱落,恢复了凝胶和电极之间的电子转移。如图4D所示,与对照组(图4C)相比,细胞出现了明显的形态变化,如变形、收缩和分泌颗粒的释放,醇溶蛋白显著增加了RBL细胞的脱颗粒,导致胞内颗粒稀疏,胞浆空泡化。通过拟合等效电路阻抗曲线,得到线性回归方程。如图4B所示,Ret和麦醇溶蛋白浓度呈正相关。线性检测范围为0.1 ~ 0.8 ng/mL,检出限为0.036 ng/mL。具有良好的稳定性和重现性。

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图6 电化学检测小麦醇溶蛋白

综上,本研究建立了一种简单新颖的食品过敏原电化学检测方法,具有在食品安全检测与评价中的潜在应用价值。

文章来源:
https://doi.org/10.1016/j.bioelechem.2021.107919



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