利用3D打印技术制备用于培育肉生产的猪骨骼肌组织

来源: 食品科学杂志  

培育肉由体外动物细胞培养发展而来，采用可控的细胞增殖、定向分化、收集和加工，代表了食品的未来。与传统的肉类生产相比，培育肉是在无菌实验室/工厂中生产的，是清洁、安全且可持续的。此外，与普通肉（或植物蛋白肉）不同，培育肉含有真正的动物蛋白，具有广阔的市场前景。作为一种新兴食品，培育肉在食用、感官、安全、营养和价格方面受到广泛关注。

培育肉生产包括动物细胞分离、体外细胞扩增、细胞定向分化、三维（3D）培养、最终获取纤维和食品加工。这一过程的目的是用少数细胞重建牲畜肌肉的复杂结构。然而，由于实验室中通常使用的培养皿只能实现二维单层细胞培养，因此可以利用组织工程构建使用支架材料的3D培养系统，以更好地模仿体内的生长环境。

3D生物打印技术被广泛应用于组织工程领域。对于培育肉生产，3D生物打印技术提供了一种从肌肉细胞获得组织结构的有效途径。由于生物墨水携带细胞并支撑结构，它们必须具有良好的机械性能和生物兼容性，这是3D生物打印的关键挑战。这些特性决定了3D结构的精度和细胞的活性。

由于水凝胶的高含水量、物理结构、机械性能和3D网络结构，目前是首选的生物墨水。水凝胶还可以模仿细胞周围的细胞外基质，为细胞生长提供有利的环境，并使细胞间相互作用和生化信号交换成为可能。各种天然水凝胶材料常用于3D生物打印系统，也广泛用于食品工业，如海藻酸盐和明胶作为食品添加剂，胶原蛋白作为外壳原料，以及丝素蛋白用于食用包装材料。

海藻酸盐是最常用的离子交联生物墨水，其特点是成型和机械性能好，与钙离子的离子固化能力强，生物相容性差。明胶-甲基丙烯酸酯（GelMA）是一种改性明胶，其溶液可以用紫外线或可见光固化成胶水；具有可打印性和可成型性的优点，但其生物相容性和机械性能仍有待优化。丝素蛋白价格低廉，具有良好的生物相容性，但机械性能较差。单一的天然凝胶材料不能完全满足一个好的生物墨水的特性；不同生物墨水的组合可以使它们各自的优势得到发挥。

在这项研究中， 中国肉类食品综合研究中心的李莹莹、王守伟等 开发了两种复合水凝胶生物墨水，即离子固化的海藻酸-明胶水凝胶（AG）和光固化的GelMA-丝素蛋白水凝胶（GS），用于构建培育肉的3D骨骼肌组织。通过改变不同比例的水凝胶生物墨水的打印特性，选择了最佳的生物墨水来构建猪骨骼肌卫星细胞（PMSCs）3D培养系统，以制备能够最好地模仿体内肌肉状态的肌肉组织，从而克服了由于PMSCs在体外的贴壁生长而导致的培育肉中小构件的限制。


生物墨水的选择和优化
流变行为
研究了AGs 1～4和GSs 0～2的流变学特性（图1）。随着温度的升高，AG和GS的储能模量（G'）和耗能模量（G''）不断下降，但G'总是高于G''，并且存在交点，这表明温度可以改变水凝胶状态。本研究中凝胶温度不同，AGs 1～4的温度分别为27.5、28.5、29.5、33.0 ℃，而GSs 0～2的温度分别为30.0、27.5、26.5 ℃。在AG中，由于明胶对温度的敏感性，明胶温度随着明胶含量的增加而增加。在GS中，由于丝素蛋白的高溶解度，凝胶温度随着丝素蛋白含量的增加而降低。

图1 不同水凝胶配方中作为温度函数的流变特性

每种水凝胶的黏度随着剪切率的增加而降低，表明所有的生物墨水都是具有剪切稀化特性的非牛顿流体，这有利于打印过程中的挤压。然而，不同生物墨水的黏度不同，AG3和AG4在100 rad/s时的黏度为9～7000 Pa·s，GS1和GS2在100 rad/s时的黏度为0.1～10 Pa·s。控制打印温度需要同时考虑到凝胶温度和黏度，使每个生物墨水在打印开始时保持一个良好的溶液或胶体状态。连续的挤压力可以确保生物材料的纤维顺利和连续地被挤压出来。此外，在凝胶温度下，所有组的tanδ值都小于1，表明每种生物墨水都趋于弹性，这种固体的特性可以增强打印结构的自我支撑能力。

机械性能
良好的机械性能使打印结构得以维持，避免结构变形、断裂和体外培养的退化，这是至关重要的，并被用作评估生物墨水性能的重要指标。本研究测定了所有打印的网格结构的完整性和稳定性。图2a和2b显示了不同水凝胶在37 ℃的DMEM溶液中的打印网格结构的代表性图像。AG4结构在第1天出现了裂缝，可能是由于高明胶浓度和低海藻酸钠比例导致了钙交联的减弱和固化不良。AG1和AG2结构在第3天出现了裂缝，但AG3在分解成几个小块之前保持了约14 d的形状。缺乏化学交联和用明胶修饰海藻酸盐可能导致这些结构的稳定性差。GS结构表现出良好的结构完整性，因为它们的形状至少在14 d内保持良好，这表明GelMA具有良好的支持性能。

图2 3D细胞打印结构的机械性能

在培养过程中，打印材料会膨胀或收缩。过度膨胀会导致结构完整性的丧失或分层结构的变形，而过度收缩则会堵塞孔隙，阻碍细胞迁移和营养物质运输。经过28 d的培养，GS2构建物保持完好，没有显示出膨胀或收缩的迹象，显示出良好的机械性能，并为细胞生长提供稳定的3D交联网络结构（图2）。

生物相容性
生物相容性是评价生物墨水模拟天然细胞能力的一个重要指标，作为细胞外基质，为细胞提供体内观察到的微环境，确保生物墨水内的细胞在固化后能保持延伸、增殖、分化和连接，实现相互交流。将混合有PMSCs的AG3和GS水凝胶打印出来，在37 ℃下培养，观察细胞生长。打印网格中的细胞密度随着培养时间逐渐增加（如图3中第1天和第3天所示），表明细胞生长。然而，各种GS结构中的细胞生长速率是不同的。随着丝素蛋白含量的增加，PMSCs进一步伸展，生长得更快，这一结果可能是由于丝素蛋白引起的水凝胶渗透性的改善，产生了更多的细胞黏附、生长和扩散的附着点。虽然AG3中的PMSCs一直在生长球状体并保持细胞的活力，但这些球状体不能伸展。由于细胞很容易被明胶包裹并容易结块，它们可以存活很长时间，但它们在支架上的附着和扩散能力较差。

图3 猪骨骼肌卫星细胞在生长过程中的形态学变化

使用细胞活力和增殖试验研究了GS水凝胶对细胞生存的影响。3D生物打印7 d后进行的活/死检测（图4）显示，GS2的总细胞数和活细胞数最高（是GS0的2倍），其次是GS1和GS0；结果与图3中的一致。在7 d的培养后，GS2的细胞分化也比GS1和GS0快（图5）。GS2中的PMSCs增殖形成一个连续的片状，形成肌管。这些结果表明，GS2表现出良好的生物相容性，有利于细胞生长、增殖和分化，因此可用于3D肌肉组织培养。

图4 7 d龄培养物的活/死细胞染色结果

图5 细胞骨架标记物肌动蛋白（绿色）和细胞核标记物4',6-二脒基-2-苯基吲哚（蓝色）的细胞分化的代表性共聚焦3D图像

3D生物打印支架的微孔结构和孔隙率
3D生物打印支架的微孔结构和孔隙率大大影响了细胞代谢。因此，有必要构建高孔隙率的支架，并选择具有良好渗透性和孔隙率的水凝胶，为细胞生长、增殖和分化提供足够的空间。支架的微孔结构和孔隙率与细胞类型和凝胶特性密切相关。

本研究中以同心圆模式研究了不同微孔尺寸对PMSCs生长的影响，在GS2中设置1.0、1.5、2.0和2.5 mm的线距，细胞密度为107 个/mL。考虑到水凝胶的厚度，打印后的支架线距离比设定值少了约0.5 mm。

图6 同心圆模式的3D打印

线距为1.0 mm（实际距离为0.5 mm）时，多层之间很容易发生堆叠，这适合于单层印刷。在其他线距下，随着培养时间的增加，支架上的细胞不断向外延伸；但只有在第5天和第10天之间观察到7～20 μm的增加，这意味着细胞活动受到抑制，因为细胞在3D打印后被限制在一个纳米级的水凝胶网络中。先前的研究表明，孔隙率临界增加会导致支架刚度下降。由于过大的线距会影响打印结构的自支撑稳定性，在本研究中，以线距1.5 mm和孔隙率1000 μm作为3D打印的标准。

与培养皿接触的打印组织底层的细胞很容易黏附在壁上并迅速生长，填充了打印组织的小孢子。因此，对于长期的3D培养，必须优化打印结构和培养皿之间的接触面积，以避免代谢通道的堵塞。

多核肌管组成的肌肉组织的形成
多核肌管的形成和肌肉组织的成熟是培育肉制造的关键步骤。由于GS2显示出最好的生物相容性和机械性能，它被进一步用来研究细胞增殖、成肌分化和肌管形成。GS2中的PMSCs表现出较高的细胞活力，并在14 d内持续增殖，尤其是从第10天到第12天（图7b）。细胞在支架上发展成致密状态（图7a），为随后的细胞分化奠定了基础。

图7 GS2中猪骨骼肌卫星细胞增殖

由于组织厚度限制了3D培养中的细胞生长，本研究分别使用了厚度为2、3、4 mm的4、6、8层的3D打印网格结构，研究不同厚度对细胞生长和成肌分化的影响。培养7 d后，大多数PMSCs呈现出纺锤形结构，尽管分化状态是不均匀的，在4层打印结构中形成更多的分化细胞和肌管。4层结构的特点是均匀的细胞分布和初步融合的肌管，而其他两种结构的细胞分布是随机的。结果表明，在培养的早期阶段，层数少的组织可能表现出更高的营养输送、细胞增殖和分化效率。

图8 培养7 d时具有4、6、8层打印结构的3D共聚焦荧光图像

培养16 d后，对4、6、8层打印结构的免疫荧光激光共聚焦成像（图9）表明，打印组织中的PMSCs伸展良好，分化并逐渐融合在一起，形成粗大的多核肌管，在肌管和椭圆形肌管包绕的肌细胞之间形成了大量紧密贴合的细胞表面排列。此时，4层和6层组织的细胞分化程度是相似的，多核肌管沿着打印网格结构的路线展开，因此整个网格结构形成了多核肌管组织的紧凑的肌肉纤维。细胞肌管的融合也发生在8层结构中，但排列紧凑程度似乎比4层和6层结构要弱。

图9 培养16 d时4、6、8层网格结构的多核肌管的2D和3D图像

本研究采用组织工程方法，利用3D生物打印技术为PMSCs构建了一个3D培养系统，为细胞提供了一个完善的生长环境，促进了细胞高存活率、增殖、肌管形成和成肌分化，从而形成猪肌肉组织。 使用GS生物墨水和3D生物打印技术生产的产品模仿了天然肌肉的结构和功能特性； 更重要的是，丝素蛋白很容易从养蚕业获得，成本低，大大降低了生物墨水的成本。 因此，该技术在生产动物骨骼肌组织供培育肉使用方面具有很大的潜力。